Yeast two- hybrid system 을 활용한 Mycobacterium smegmatis 의 일산화탄소 산화관련 유사 유전자와 상호작용하는 단백질 분석

1. Yeast two- hybrid system 을 활용한 Mycobacterium smegmatis 의 일산화탄소 산화관련 유사 유전자와 상호작용하는 단백질 분석 이정은

2. 연구 배경과 목적 • Mycobacterium smegmatis • 호기적 조건하에서 일산화탄소(CO)를 유일한 에너지 및 탄소원으로 이용하여 성장할 수 있는 carboxydobacteria • CO를 산화하는데 필수적인 효소인 CO dehydrogenase (CO-DH) 존재함 • CO-DH는 물을 산화제로 이용하여 CO를 CO2로 산화시키는 주 효소 • CO + H2O ---------- CO2 + 2H + 2e • Carboxydobacteria에서 CO-DH 유전자 주변에 기능이 알려지지 않은 orf들이 conserve 되어 있다. • CO-DH 유전자 주변에 이러한 orf들이 conserve되어 있음을 보고 판단할 때 이들 orf들이 CO-DH와 관련되어 있을것이라 추정되므로 이들orf가 CO-DH와 interacting 하는지 또는 이들 orf들 끼리 interaction하는지 알아보고자 하였다 또한 이들 Orf와 interating 하는 다른 protein이 있는지 알아보기로 한다. CO-DH + -

3. cutC cutA orf2 orf3 orf4 cutB orf5 cutR Copy 1 Mycobacterium sp. strainJC1 cutC cutA orf2 orf3 orf4 orf6 cutB orf5 orf1 Copy 2 M. tuberculosis M. smegmatis M. bovis M. marinum M. leprae 17.5 kb Oligotropha carboxidovorans Hydrogenophaga pseudoflava Pseudomonas thermocarboxydovorans Arthrobacter sp. FB24

4. Yeast two-hybrid system • 이미 알고 있는 두 단백질 간의 상호작용을 확인하고자 할 경우나, 이미 알고 있는 단백질과 상호 작용하는 또 다른 단백질을 스크리닝 하고자 할 때 사용할 수 있다. • Regulator 들은 특정 염기 서열로 이루어진 promtor부위와 결합하는 DNA- binding domain과 RNA polymerase II 복합체와 직접적으로 작용하여 transformation에 관여하는 기능을 수행하는 activation domai 으로 구성되어 있다. • Recombinant DNA technology 로 분리된 DNA- binding domain 과activation domain은 상호작용이 가능한 단백질을 각각의 domain의 유 전자에 결합시켜 yeast에 발현 시키면 두 단백질에의 상호작용에 의해 두 domain이 transcription과 관련된 기능을 하게 됨으로써 유전자 발현이 가능해짐.

5. 연구 방법 • 1.Yeast two-hybrid system을 위한 plasmid 제작 • 1) bait vector 제작 • 2) prey vector 제작 • 2.Yeast transformation

6. Bait vector 제작 Orf5 or Orf6가 만들어지도록 primer 제작 Orf5 F: 5’ GAA TTC ATG AAG ATC GCG AAC GAG TTC ACT G 3’ R: 5’ GGA TCC TCA TCT GCC GCG AAG GGC CT 3’ Orf 6 F: 5’ GAA TTC ATG ACC GCA CCG CTG CTG CT 3’ R: 5’ GGA TCC CTA AGC CCC GAG CAC GTC GA 3’ Orf 5 / Orf 6PCR 수행 Template(Msm genomic DNA) 1 ㎕ Prrimer(F, R) 1 ㎕씩 Ex taq 0.5 ㎕ dNTP 4 ㎕ 10 X Ex taq buffer 2 ㎕ D.W 11.5 ㎕ 1 2 1 2 3 Lane 1: 1kb ladder Lane 2 :Orf5의 PCR product from ch’mal DNA of M. smegatis Lane 1 : 1kb ladder Lane 2,3 :Orf6의 PCR product from ch’mal DNA of M. smegatis Orf5 PCR product (700 bp) Orf6 PCR product (1194 bp)

7. Bait vector 제작 • Sequencing the cloned pGEM-T easy vector containing PCR product • Ligate with cloned PCR product with pAS2-1 for bait vector

8. Bait vector 제작 1 2 3 4 5 Lane1,2,3,4 : pAS2-1 with orf5 를 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut Lane5 : 1kb ladder Orf5 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut Vector size: 8392 bp Insert size(orf5 ):700 bp Orf6 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut Vector size: 8392 bp Insert size(orf6 ):1194 bp

9. Prey vector 제작 • Orf5 or Orf6가 만들어지도록 primer 제작 • Orf 5 F: 5’ GGA TCC GAT GAA GAT CGC GAA CGA CTT 3’ R: 5’ GAA TTC CTA TCA TCT GCC GCG AAG GGC CT 3’ • Orf 6 F: 5’ GAA TTC CTA AGC CCC GAG CAC GTC GAA CAA 3’ R: 5’ GGA TCC GAT GAC CGC ACC GCT GCT GCT3’ • Orf 5 / Orf 6PCR 수행 • Template(Msm genomic DNA) 1 ㎕ • Prrimer(F, R) 1 ㎕씩 • Ex taq 0.5 ㎕ • dNTP 4 ㎕ • 10 X Ex taq buffer 2 ㎕ • D.W 11.5 ㎕ 1 2 3 4 5 1 2 3 4 Lane 1: 1kb ladder Lane 2,3,4 :Orf5의 PCR product from ch’mal DNA of M. smegatis Lane1,2,3,4 :Orf6의 PCR product from ch’mal DNA of M. smegatis Lane 5 : 1kb ladder Orf5 PCR product (700 bp) Orf6PCR product (1194 bp)

10. Prey vector 제작 • Sequencing the cloned pGEM-T easy vector containing PCR product • Ligate with cloned PCR product with pGAD GH for prey vector

11. Prey vector 제작 1 2 3 4 5 Lane1 : 1kb ladder Lane,2,3,4,5 : pGAD GH with orf5 를 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut Orf5 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut Vector size: 8009 bp Insert size(orf5 ):700 bp 1 2 3 4 5 Lane1 : 1kb ladder Lane,2,3,4,5 : pGAD GH with orf6 를 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut Orf6 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut Vector size: 8009 bp Insert size(orf6 ):1194 bp

12. Yeast transformation 1. Inoculate yeast colony into 1 ml of YPD 2. 30℃,250 rpm에서 2~3 일 정도 키운다. 3. 키운 yeast (1 ml)을 50 ml of YPD에 옮긴다. 4. 다시 30℃, 250 rpm에서16~18시간 정도 키운다. 5. 잘 키운 yeast (30 ml) 를 300 ml 의 YPD에 옮긴다. 6. 다시 30℃, 230~270 rpm에서 3시간 정도 키운다. 7. 1000 x g, 25℃, 5 min centrifuge 8.40 ml의 증류수 또는 TE에 resuspend

13. Yeast transformation 9. 1000 x g, 25℃, 5 min centrifuge 10. 1.5 ml의 1x TE/1x LiAc에 resuspend 11. 0.1 ㎍ of plasmid DNA (co- transformation일 경우, 각각 0.1 ㎍)와 0.1 ㎎ of herring sperm DNA 를 새 1.5 ml tube에 넣는다. 12. 0.1 ml의 yeast competent cell을 넣고 잘 섞는다. 13. 0.6 ml의 PEG / LiAc 용액을 넣고 10초간 vortex 14. 30℃, 200 rpm에서 30분간 배양한다. 15. 70 ㎕의 DMSO를 넣고, 위 아래로 5회 뒤집어 섞는다.

14. Yeast transformation 16. 42℃, 15분간 heat shock. 17. 얼음에 1-2 분간 방치 18. 14,000 rpm 으로 5초간 원심 분리 후, 상층액을 버린다 19. 0.5 ml의 TE에 resuspend. 20. 100 ㎕ 씩 SD+ DO 배지에 spreading ( DO: -Trp, -Leu,-His,-Ade /- Trp, -Leu)

15. 앞으로의 실험 계획 • 제작되어 있는 orf 들의 bait vector와 prey vector를 이용하여 이들 Orf들 어떤 상호작용이 있는지 확인한다. • 알고 있는 protein과 상호 작용하는 unknown protein 어떤 protein인지 알아 보기 위해 Mycobacterium smegmatis 의 cDNA library를 제작한다. • 이런 protein이 발현 될 수 있는 express vector(prey vector)를 만든다. • Yeast two-hybrid 방법을 이용하여 CO-DH 유전자 주변에 conserve 되어 있는 orf들과 interaction하는 unknown protein을 스크리닝한다.