“Методы лабораторного исследования гемостаза”

1. “Методы лабораторного исследования гемостаза” 1. Скрининговые исследования 2. Исследование сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза

2. Лабораторные методы, используемые в исследовании гемостаза: • Клоттинговые: (ВСК, ПВ, АПТВ, ТВ …)‏ • Хромогенные: (активность ATIII, PC, Pl)‏ • Иммунологические:(количество отдельных факторов)‏ • ПЦР: (ДНК-диагностика наследственных гемофилий и тромбофилий: аномалия Лейдена, гомоцистеинемия, дефицит AT)‏ • Проточная цитофлуориметрия: (определение рецепторов тромбоцитов)‏ • Нефелометрия: (исследование функции тромбоцитов по методу Born)‏

3. Клоттинговые методы: - основаны на определении времени образования, а также растворения сгустка в стандартных условиях; - определяется активность отдельных звеньев системы свертывания и фибринолиза.

4. Хромогенные методы: - это хромогенное (оптическое) определение хромогенных (окрашенных) веществ (нитроанилина) связанных с субстратами (белками) специфических реакций; - так определяется активность отдельных компонентов свертывающей, антитромбиновой или фибринолитической системы. Пример: Стрептокиназа + плазминоген** = плазмин + свободный нитроанилин**(желтая окраска)‏

5. Скрининговые тесты гемостаза: 1) Определение резистентности микрососудов: - манжеточная проба; -баночная проба; -проба щипка 2) Определение времени кровотечения: - по Дьюка; - по Айви; - по Шитиковой 3) Определение времени свертывания крови: - по Ли и Уайту

6. Манжеточная проба Выполнение: Создают венозный стаз путем дозированного сжатия плеча манжеткой тонометра (90 мм на 5 минут) и подсчитывают количество петехий в в верхней ладонной поверхности предплечья и локтевого сгиба. Клиническое значение: Положительная проба возможна при врожденной ломкости капиляров, тромбоцитопении, значительной тромбоцитопатии, гиповитаминозе С, болезни Виллебранда, приеме непрямых антикоагулянтов, гормональном сдвиге у женщин, ДВС-синдроме.

7. Время кровотечения - тест общего состояния сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза Выполнение: Определяют длительность кровотечения из микрососудов кожи после дозированного (3 мм) прокола ее ланцетом. Клиническое значение: Удлинение времени кровотечения возможна при значительной тромбоцитопении, тяжелых формах тромбоцитопатии (тробастения Гланцмана), болезни Виллебранда, приеме непрямых антикоагулянтов, гормональном сдвиге у женщин, ДВС-синдроме.

8. Оценка работы первичного гемостаза

9. Оценка работы первичного гемостаза Прибор для количественной оценки гемостатической функции тромбоцитов Platelet Function аnalyzer-100

10. Определение количества тромбоцитов: (170-350х10/л)‏ 1) В мазке по Фонио: не может быть рекомендован из-за малой точности. 2) Подсчет в камере Горяева после гемолиза эритроцитов оксалатом аммония. 3) С помощью автоматического счетчика в венозной крови, стабилизированной ЭДТА.

11. Исследование функции тромбоцитов Выполняется из венозной крови, стабилизированной цитратом натрия в соотношении 1/9; в течении 1 часа после забора крови. Богатая тромбоцитами плазма- отбирают после центрифугирования крови при 1000 оборотов /6 минут Бедная тромбоцитами плазма- отбирают после центрифугирования крови при 3000 оборотов/ 15 минут

12. Исследование функции тромбоцитов: РЕТРАКЦИЯ В ПЛАЗМЕ (богатой тромбоцитами)‏ Пробирка полистироловая мерная: 2,5 мл забуференного физ.раствора 0,2 мл тромбина 0,2 мл Ca Cl2 (0,277%)‏ Добавить 0,2 плазмы, богатой тромбоцитами Перемешать, вылить в пластиковый шприц на 5,0 мл инкубировать 60 минут при 370С Вынуть сгусток Замерить объем Расчет: Vост/ Vобщ . 100%

13. Исследование агрегации тромбоцитов • ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД Борна- основан на регистрации изменений светопропускания богатой тромбоцитами плазмы после активации индукторами. • Индукторы агрегации - естественные или искуственные активаторы: • АДФ; • Адреналин; • Коллаген; • Ристоцетин и др.

14. Агрегометр HELENA PACKS-4 • СПИСОК МЕТОДИК: • Агрегация с АДФ • Агрегация с эпинефрином • Агрегация с коллагеном • Агрегация с ристоцетином • Агрегация с арахидонатом • Активность фактора фон Виллебранда (по ристоцетин-кофакторной активности)‏ • Хромогенное определение: • Антитромбина III • Плазминогена • Протеина С • Гепарина • Активности фактора VIII

15. Агрегометры AP 2110 Анализатор агрегации тромбоцитов предназначен для исследования in vitro агрегационных свойств тромбоцитов турбидиметрическим методом. Анализатор агрегации тромбоцитов АMS 600

16. Агрегометры • Агрегометр LA230 ( " БИОЛА" Россия) Двухканальный анализатор агрегации тромбоцитов • Прибор позволяет проводить в каждом канале исследования агрегации тромбоцитов методом светопропускания и определения среднего радиуса тромбоцитарных агрегатов. Агрегометр тромбоцитарный "CHRONOLOG CORP." (США) Агрегометр 430 (одноканальный) Агрегометр 440VS(двухканальный) Агрегометр 470VS(четырехканальный) Оптический анализатор агрегации тромбоцитов служит для исследования агрегационных свойств тромбоцитов в плазме.

17. Оптическая агрегометрия используется для исследования процессов агрегации на плазме обогащенной тромбоцитами (PRP), а также для измерения агглютинации латексных частиц и для исследования изменения формы взвешенных частиц. Оптические агрегометры «Хроно-лог» с успехом используются во всем мире уже многие годы, начиная с 1967 г и являются «золотым» стандартом в оптической агрегометрии. Двойной инфра-красный луч и чувствительный фотодетекторный модуль используется для определения разницы в световом прохождении между плазмой обогащенной и обедненной тромбоцитами. Цельная кровь, разведенная кровь, плазма обогащенная тромбоцитами, отмытые тромбоциты, отмытые лейкоциты – все эти образцы могут быть измерены с помощью импедансной технологии. Корпорация «Хроно-лог» обладает патентом на применение этого метода.

18. Широкий спектр люминисцентных реакций (выброс АДФ, уровень ионизированного кальция, генерация супероксидов и др.) может быть измерен при помощи ультра-чувствительной фотоумножительной трубки, которая испльзуется в люми-агрегометрах корпорации “Хроно-лог”. Люминисценция используется для детекции всех дефектов накопления и секреции. Этот метод также достаточно чувствительный для детекции гепарин-индуцированной тромбопении.

19. Тромбоэластограф Гематокоагулограф ГКГМ4-02 тромбоэластограф

20. роТЭГ " • Анализатор гемостаза роТЭГ " это современный 4-х канальный компьютерный тромбоэластограф. ОСНОВНЫЕ ИЗМЕРЯЕМЫЕ ПАРАМЕТРЫ CT (время коагуляции) - общая активность коагуляционной системы CFT (время образования сгустка) и a-угол (начальная скорость оборазования сгустка) – оценка функции тромбоцитов, действия фактора XIII, полимеризации фибрина, активности гепарина MA (или MCF) – качество сгустка, оценка его механических свойств LOT (время наступления фибринолиза) – оценка фибринолитической активности l-угол – скорость фибринолиза ПРИМЕРЫ ГРАФИКОВ

21. ИДЦ 2008-2011г.г. Автоматический коагулометр STA-R Evolution Roche Diagnostics, Франция

22. Гемостаз в ИДЦ

23. Полный гематологический анализ Миелограмма Протромбиновое время и фибриноген Коагулограмма стандартная Ретикулоциты Цитограмма (мазок из носа или глаза) LE-клетки Осмотическая резистентность эритроцитов Ретракция плазменного сгустка Агрегация тромбоцитов с АДФ Агрегация тромбоцитов с ристоцетином Агрегация тромбоцитов с арахидоновой кислотой Агрегация тромбоцитов с коллагеном Агрегация тромбоцитов с адреналином Определение фактора Виллебранда Активность фактора свертывания крови XII Активность фактора свертывания крови VIIIАктивность фактора свертывания крови IXАктивность фактора свертывания крови XI Активность комплекса протеина С (скрининг) Активность антитромбина III Активность протеина С Активность плазминогена Активность альфа-2-антиплазмина АПТВ с люпус-чувствительным кефалином Время кровотечения Коррекционно-ингибиторная проба по АПТВ Коррекционно-ингибиторная проба по ПТИ Определение групповой принадлежности по АВО Определение резус-антигенов Фибринолиз Активность фактора свертывания крови II Активность фактора свертывания крови V Активность фактора свертывания крови VII Активность фактора свертывания крови X Активность фибриназы (фактор XIII) Коагулограмма (тромбогенный риск) Протромбиновое время (с МНО) Фибриноген Активированное время рекальциф Активированное парциальное тро Тромбиновое время Растворимые фибрин-мономерные Содержание Д-димера Спектр анализов лаборатории гематологии ИДЦ с учетом гомеостатических методов

24. TGA-анализ – универсальный метод оценки тромбогенного потенциала гемостаза • Диагностика тромбофилий • Диагностика гемофилий • Мониторинг противо-гемофилийной терапии для пациентов с наличием ингибитора фактора VIII • Мониторинг антикоагулянтной терапии, направленной на ингибирование тромбина и фактора Xa(гепарин)

25. CEVERON-ALPHA для 4 методов анализа: • - коагулометрия АЧТВ, ПВ, ТВ, Фибриноген, Протеин С, ВА, дефицит факторов свертывания, мутация Лейдена и другие. • - фотометрияС1-ингибитор, FVIII, Протеин С, АТ-III и другие. • - турбидиметрияД-димер, ВА, С-реактивный белок и другие. • - флуориметриякинетика образования эндогенного тромбина (для модификации Ceveron TGA) • Автомат CEVERON-ALPHA TGA позволяет проводить уникальный флуориметрический TGA-анализ • 360/430 нм • Длины волн фотометрического блока:405, 570, 630 и 740 нм • Скорость проведения анализов на CEVERON-ALPHA до 70 образцов/час (ПВ) (Стационар на 300-400 больных)

26. Спасибо за внимание!