实验五、 PCR 扩增 16SrDNA

1. 实验五、PCR扩增16SrDNA 一、实验原理 1、PCR • 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间， 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。

2. ＰＣＲ技术实际上是模拟体内DNA合成过程，是在模板ＤＮＡ， 引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。 反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（ex tension），反应过程见图。

3. PCR（Polymerase Chain Reaction) 的原理

4. 一、实验原理 2、 16SrDNA的核酸序列分析 16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）的基因，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。 16SrRNA的序列高度保守，可精确指示细菌之间的亲缘关系，16SrRNA的大小为1500bp左右，所含信息能反映生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。 目前常用的是建立在PCR技术基础上的16SrRNA基因的直接测序法，方便快捷。

6. 较之23SrDNA等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称。较之23SrDNA等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称。 其序列包含10个可变区（variable region）和与之相同的11个恒定区（constant region），可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。

7. 二、PCR标准反应体系 • DNA模板 • 引物 • 反应缓冲液 • dNTP • ddH2O • 耐热聚合酶

8. 二、PCR标准反应体系 • １．ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高， 以增加反应特异性。 • ２．dNTP:反应体系中达100μM～200μM。 • ３．Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。 • ４．引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40 ％－70％之间；引物内部不能有回该序列；引物３’端不能互补。 • ５．Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。

9. 二、PCR标准反应体系 • ６．变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。 • ７．复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定， 它是反应特异性的决定因素。 • ８．延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应温度。

10. PCR法的操作过程 Step 1:DNA热变性 Step 2:引物退火 Step 3:引物延伸

11. 例如： • 模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链； 在５５℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ聚合酶Taq 酶催化下， 在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。 接着又以新合成的ＤＮＡ为模板进行同样反应，如次往复循环３０次，由于每次循环目标ＤＮＡ都以２n次幂扩增，３０次循环后目的DNA的量增加１０６－７倍。成功的ＰＣＲ反应要求反应有很好的特异性，和相当的扩增效率。

12. 三、反应体系对PCR扩增的影响 • 纯度：蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 • 完整性：模板降解会导致PCR扩增无产物 • 浓度： 加量过多导致非特异性扩增增加 • 特异性：长度适当、避免二级结构和二聚体 • 完整性：避免反复冻融 • 浓度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少 DNA模板 引 物

13. 三、反应体系对PCR扩增的影响 • pH值,盐离子浓度 • 稳定剂,增强剂 反应Buffer • 过高非特异性严重 • 过低无扩增产物 Mg 2＋浓度 • 浓度适当 • 避免反复冻融 dNTP Mixture • pH值适当 • 避免污染 ddH2O

14. 四、材料、设备及试剂 设备 ：eppendorf管、微量取液器， 台式 高速离心机， 电泳仪、 电泳槽、UVP凝胶成像系统、PCR仪 试剂：16SrDNA引物、细菌基因组DNA、Taq Plus、dNTP、 PCR 反应缓冲液、琼脂糖 、TAE电极缓冲液、 Lamdar DNA/HindⅢ 、EB 、 加样缓冲液

15. 五、操作步骤 （一）、PCR反应 1. 依次混匀下列试剂 5μl 10×PCR反应缓冲液 1μl 4种dNTP 2μl 上游引物（引物１） 2μl 下游引物（引物２） 1μl 模板DNA 0.5μl Taq DNA聚合酶 38.5μl H2O 混匀后离心5秒。 （二）扩增：用94℃变性3分钟， 94℃变性1分钟，61℃退火1分钟, 72℃延伸1分钟, 循环30轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下最后延伸5分钟，使反应产物扩增充分。 （三）电泳鉴定：方法同实验二（2%琼脂糖凝胶） 实验结果：分析PCR产物电泳结果

16. 六、PCR常见问题分析 问题一：无扩增产物 • 现象：正对照有条带，而样品则无； 原因 • 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 • 更换Buffer或调整浓度 • 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 • 降低退火温度、延长延伸时间 • 模板:含有抑制物，含量低 • Buffer对样品不合适 • 引物设计不当或者发生降解 • 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对 策

17. 六、PCR常见问题分析 问题二：非特异性扩增 • 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

18. 问题二：非特异性扩增 原因 • 重新设计引物或者使用巢式PCR • 适当降低模板或引物浓度 • 适当减少酶量 • 降低镁离子浓度 • 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 • 减少循环次数 • 引物特异性差 • 模板或引物浓度过高 • 酶量过多 • Mg2+浓度偏高 • 退火温度偏低 • 循环次数过多 对 策

19. M 1 2 六、PCR常见问题分析 问题三：拖尾 • 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

20. 问题三：拖尾 原因 • 模板不纯 • Buffer不合适 • 退火温度偏低 • 酶量过多 • dNTP、Mg2+浓度偏高 • 循环次数过多 • 纯化模板 • 更换Buffer • 适当提高退火温度 • 适量用酶 • 适当降低dNTP和镁离子的浓度 • 减少循环次数 对 策

21. 六、PCR常见问题分析 问题四：假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况) • 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 对 策 • 靶序列或扩增产物的交叉污染

22. 七、问题与讨论 1、简述ＰＣＲ基本原理 2、进行一次成功的ＰＣＲ反应顺注意哪些问题。 3、谈谈你对基因工程实验课程的想法与建议。