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青枯雷尔氏菌致病性差异及其相关基因的分析

青枯雷尔氏菌致病性差异及其相关基因的分析. 答辩人 ：林海云 专 业：农药学 导 师： 刘 波 研究员 关 雄 教 授. 主要内容. 研究背景 技术路线 研究内容 结论与展望 发表论文 致 谢. 一、研究背景. 1、 青枯雷尔氏菌 （ Ralstonia solanacearum ） 菌株特性. 侵染植物种类多； 菌系存在多样性； 致病性机制十分复杂； 存在2种致病力分化。. 一、研究背景. 2、 青枯雷尔氏菌致病性的分子机制. 致病性基因： hrp 基因（ Ⅲ 型分泌系统）和 dsp 基因.

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青枯雷尔氏菌致病性差异及其相关基因的分析

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  1. 青枯雷尔氏菌致病性差异及其相关基因的分析 答辩人 ：林海云 专 业：农药学 导 师：刘 波 研究员 关 雄 教 授

  2. 主要内容 • 研究背景 • 技术路线 • 研究内容 • 结论与展望 • 发表论文 • 致 谢

  3. 一、研究背景 1、青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）菌株特性 • 侵染植物种类多； • 菌系存在多样性； • 致病性机制十分复杂； • 存在2种致病力分化。

  4. 一、研究背景 2、青枯雷尔氏菌致病性的分子机制 • 致病性基因： hrp基因（Ⅲ型分泌系统）和dsp基因 • 毒性基因： 胞外酶基因、胞外多糖基因和脂多糖基因（Ⅱ型分泌系统） • 无毒基因：popA

  5. 一、研究背景 3、青枯雷尔氏菌致病基因的调控网络 • 低细菌密度，phcA不激活 • 高细胞密度，激活phcA：EPS，β-1,4-内切葡聚糖酶等酶产生，抑制聚半乳糖醛酸酶，hrp基因 到目前为止，尚未有任何证据表明强致病力菌和无致病力菌在分子水平上的本质差异。

  6. 一、研究背景 • 基因组（碱基总数）：5628728 bp • 预测：6969个基因 • 基因密度达到79.11% • 基因功能注释：1753个基因有基因名 FJAT-91 FJAT-1458 • 基因组（碱基总数）：5944939 bp • 预测：7753个基因 • 基因密度达到79.53% • 基因功能注释：1911个基因有基因名

  7. 一、研究背景 4、研究目的及创新性 • 通过对青枯雷尔氏菌遗传多样性进行研究，并揭示其多样性的原因。 • 通过对青枯雷尔氏菌致病性相关基因研究，以揭示青枯雷尔氏菌导致致病性差异的原因。

  8. 菌种库 青枯雷尔氏菌 致病性相关基因检测 青枯雷尔氏菌 遗传多态性分析 青枯雷尔氏菌 特异性引物鉴定 青枯雷尔氏菌 形态学鉴定 生长曲线 紫外扫描 蛋白质差异 青枯雷尔氏菌 hrp，phcA等 BOX-PCR REP-PCR 青枯雷尔氏菌 致病性检测 青枯雷尔氏菌典型代表菌株 青枯雷尔氏菌生理生化检测 二、技术路线

  9. 3 三、研究内容 青枯雷尔氏菌致病性检测 1 青枯雷尔氏菌遗传多样性分析 2 青枯雷尔氏菌致病性相关基因检测 青枯雷尔氏菌生理生化测定 4

  10. 菌落形态鉴定 分子鉴定 弱化指数测定 致病性梯度检测 致病性检测 青枯雷尔氏菌 TTC培养基，30℃ 特异引物： peh#6和peh#3 不同菌液浓度：109、107、105、103、101个/mL接菌 70%、30℃ 弱化指数=红边直径/白边直径 聚类分析：欧式距离法、 离差平方和法 合适梯度、 70%、30℃ 三、研究内容 1、青枯雷尔氏菌致病性检测

  11. 三、研究内容 1、青枯雷尔氏菌致病性检测 • 菌落形态鉴定 分离了107株菌，强致病力、无致病力以及非青枯雷尔氏菌 无致病性菌 强致病性菌 非青枯雷尔氏菌 • 分子鉴定 利用青枯雷尔氏菌特异性引物鉴定，共鉴定出85株菌。 pehA#6：5'-ATCGGACTTGATGCGCAGGCCGTT-3' pehA#3：5'-CAGCAGAACCCGCGCCTGATCCAG-3‘

  12. 三、研究内容 1、青枯雷尔氏菌致病性检测 • 弱化指数测定 类群Ⅰ：弱化指数<0.714； 类群Ⅱ：弱化指数0.714-0.833； 类群Ⅲ：弱化指数>0.833； Ⅰ强致病性Ⅱ过渡区 Ⅲ 无致病性 CK • 致病性检测 强致病性菌 死亡率>70% 类群Ⅰ：主要为强致病力菌，占52.38%，强致病力菌73.33%被归为类群Ⅰ； 类群Ⅱ：主要为过渡型菌，占56.67%，过渡型菌56.56%被归类群Ⅱ中； 类群Ⅲ：主要为无致病力菌，占69.23%，无致病力菌56.25%被归在类群Ⅲ。 无致病性菌 死亡率<30% 过渡型菌 死亡率30%-70%

  13. 青枯雷尔氏菌 BOX-PCR REP-PCR 分子多态性 地理特性 寄主特性 REP1R：5'-III ICGICGICATCIGGC-3'REP 2-1：5'-ICGICT TATCIGGCC TAC-3' BoxA1R：5'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3' 以分离自宁德屏南的菌株作为研究对象，REP-PCR 聚类分析：欧式平方距离，离差平方和法 根据BOX-PCR和REP-PCR条带扩增结果：无带计为“0”，强带和弱带均计为“1”。 聚类分析：欧式平方距离，类间平均连锁法 以分离自番茄植株的菌株作为研究对象，BOX-PCR 聚类分析：欧式平方距离，最远距离法 三、研究内容 2、青枯雷尔氏菌遗传多样性分析

  14. BOX-PCR多态性分析 bp bp 3000 3000 360 1000 1000 500 500 三、研究内容 2、青枯雷尔氏菌遗传多样性分析 20条条带，360 bp为所有菌株共有的条带，多态性带比率达到 95.00%。

  15. REP-PCR多态性分析 bp bp 280 400 3000 3000 700 1000 1000 500 500 三、研究内容 2、青枯雷尔氏菌遗传多样性分析 23条条带，280、400和700 bp为共有条带，多态性带比率达到86.96%。

  16. 生姜 辣椒 类群 I 类群Ⅱ 番茄 茄子 类群Ⅲ 花生番茄 类群Ⅳ λ=22 三、研究内容 2、青枯雷尔氏菌遗传多样性分析 • 分子多态性分析 • 第I类群：生姜和辣椒 • 第II类群：番茄 • 第III类群：茄子 • 第IV类群：花生和番茄 • 卡方检验 • BOX-PCR（20条）P<0.05共14条，占总条带的32.56% • REP-PCR（23条）P<0.05共18条，占总条带的41.86%。

  17. Ⅰ Ⅱ Ⅲ 三、研究内容 2、青枯雷尔氏菌遗传多样性分析 • 地理特性分子多态性分析 类群Ⅰ：闽东地区 （700 bp和900 bp） 类群Ⅱ：闽北地区 （200 bp、750 bp和950 bp） 类群Ⅲ：闽中地区 （700 bp和2000 bp） 闽东地区 闽北地区 聚类分析（SPSS16.0） 最远距离法 欧氏距离 闽中地区 λ=20 不同地区青枯雷尔氏菌聚类分析结果（分离自番茄）

  18. 类群Ⅰ 茄子 番茄 类群Ⅱ 辣椒 类群Ⅲ 辣椒 番茄 λ=8 不同寄主青枯雷尔氏菌聚类分析结果 （分离自宁德屏南） 三、研究内容 2、青枯雷尔氏菌遗传多样性分析 • 寄主特性分子多态性分析 类群Ⅰ：茄子和番茄 （1050 bp和2000 bp） 类群Ⅱ：辣椒 （1700 bp和2100 bp） 类群Ⅲ：辣椒和番茄 （1250 bp、1500 bp和3000 bp） 聚类分析（SPSS16.0） 离差平方和法 欧氏距离

  19. 根据FJAT-91和FJAT-1458的全基因组序列数据，比对两者基因组数据库的差异，找出强致病性和弱致病性菌株中的差异显著基因----10个.根据FJAT-91和FJAT-1458的全基因组序列数据，比对两者基因组数据库的差异，找出强致病性和弱致病性菌株中的差异显著基因----10个. 获得基因 致病性相关基因检测 致病性基因结果分析 典型代表菌株 致病性相关基因 phcA基因 hrp基因 RS600和RS61； RS30和RS31； RS20和RS201； phc1 pCA2 PCR扩增结果：无带计为“0”，强带和弱带均计为“1”。 聚类分析：欧氏距离法，离差平方法。 弱化指数，致病性检测，基因结果检测 卡平方检验 三、研究内容 3、青枯雷尔氏菌的致病相关基因检测

  20. bp bp 3000 3000 1000 1000 500 500 三、研究内容 3、青枯雷尔氏菌的致病相关基因检测 • hrp基因簇检测（hrpB、hrpC、hrpV、hrpU、hrpT、hrpQ、hrpO和hrpN） hrpB-hrpC hrpB-hrpC 905 bp 905 bp 1993 bp 1452 bp hrpV-hrpU-hrpT-hrpQ hrpO-hrpN 这些核酸序列强致病力和无致病力菌株均存在。

  21. bp A bp 3000 3000 1000 1000 500 500 三、研究内容 3、青枯雷尔氏菌的致病相关基因检测 • phcA基因检测 • 菌株FJAT-1452、FJAT-1453、FJAT-1458和FJAT-1463：3000 bp； • 其他菌株：1281 bp。 phcA基因可能在致病性强弱调控方面起着重要作用。

  22. 三、研究内容 3、青枯雷尔氏菌的致病相关基因检测 • phcA基因分析 FJAT-91(JN630465) FJAT-1458(JN630466) NCBI比对： 1-304 bp，100%；297-1281 bp与后者2337-3321 bp，100%。 FJAT-1458中的phcA基因——8 bp正向重复序列，并插入了2032 bp片段

  23. 三、研究内容 3、青枯雷尔氏菌的致病相关基因检测 • 插入序列分析（JN630467） • 总长度：2032 bp； • 反向重复序列：25bp； • 正向重复序列：8 bp； • 属于ISL3家族 ORF1，转座酶； ORF2，甲基转移酶； ORF3，未知蛋白。 • IRL：GGCTCAACGGATTACTGTGTGGAAA • IRR ：TTTACACACGATATTCCGTAGAGCC 命名为 ISRso21（IS Finder） 青枯雷尔氏菌中首次发现的。

  24. bp bp 3000 3000 A A 1000 1000 500 500 三、研究内容 3、青枯雷尔氏菌的致病相关基因检测 • 插入序列 ISRso21分布 总检出率为30.59% 无致病力菌株：35.71% 强致病力菌株：29.58% 闽中地区：0.00%， 闽东地区：30.77%， 闽北地区：81.82%。 皮尔逊卡方值为18.819，P<0.05。 ISRso21分布与其地域性有关系

  25. 3000 bp 3000 1000 1000 500 500 三、研究内容 3、青枯雷尔氏菌的致病相关基因检测 • IS序列插入位点的验证（phcA基因上游的插入） bp A 检出率：4.71% 无致病力菌株：28.57% 强致病力菌株：0.00% 在phcA基因上游中插入：FJAT-1453、FJAT-1452、FJAT-1458和FJAT-1463

  26. bp bp 3000 3000 A 1000 1000 500 500 三、研究内容 3、青枯雷尔氏菌的致病相关基因检测 • IS序列插入位点的验证（二氨基庚二酸脱羧酶的插入） 检出率：28.24% 无致病力菌株：28.57% 强致病力菌株：28.17% 共24株菌，IS插入的二氨基庚二酸脱羧酶在无致病力菌与强致病力菌均存在

  27. 三、研究内容 3、青枯雷尔氏菌的致病相关基因检测 • 特异性获得相关基因筛选 整合酶催化基因： Integrase catalytic region（Icr） 依赖DNA的RNA聚合酶基因： DNA-dependent RNA polymerase（RNAP） PBCV-1 DNA连接酶基因： PBCV-1 DNA ligase（PBCV-1） 编码HK97家族噬菌体蛋白基因： HK97 family phage protein（HK97） caudovirus前体蛋白酶基因：caudovirus prohead protease（Cpp） hypothetical protein Bmul_0496基因： （Bmul） 编码共合体决定蛋白T基因： cointegrate resolution protein T（CorT） peptidase U35 phage prohead HK97基因： （U35） 甲基转移酶基因： methyltransferase（Met） 编码噬菌体蛋白GP46基因： bacteriophage protein GP46（GP46）

  28. 400 bp HK97 family phage protein methyltransferase 三、研究内容 3、青枯雷尔氏菌的致病相关基因检测 • 特异性获得相关基因PCR程序摸索 60 ℃：编码HK97家族噬菌体蛋白 hypothetical protein Bmul_0496 61℃：整合酶催化基因 编码噬菌体蛋白GP46基因； 62 ℃：PBCV-1 DNA连接酶基因 peptidase U35 phage prohead HK97基因 甲基转移酶基因 64 ℃：依赖DNA的RNA聚合酶基因 编码共合体决定蛋白T基因 65 ℃：caudovirus前体蛋白酶基因 DNA-dependent RNA polymerase

  29. bp 1500 500 三、研究内容 3、青枯雷尔氏菌的致病相关基因检测 • 特异性获得相关基因检测 Integrase catalytic region DNA-dependent RNA polymerase 不同特异性获得相关基因在弱化指数不同类群中的分布

  30. 类群Ⅰ 类群Ⅱ 类群Ⅲ 三、研究内容 3、青枯雷尔氏菌的致病相关基因检测 • 致病性相关基因综合分析 菌落形态 弱化指数分类 致病性检测结果 致病性相关基因 λ=11 强致病力代表菌： FJAT-91和FJAT-433 过渡型代表菌： FJAT-474、FJAT-472、FJAT-433和FJAT-465 无致病力代表菌： FJAT-1303、FJAT-1452和FJAT-1453

  31. 三、研究内容 3、青枯雷尔氏菌的致病相关基因检测 • 致病性相关基因综合分析（图谱条带分析） 编码共合体决定蛋白T基因 甲基转移酶 整合酶催化基因 依赖DNA的RNA聚合酶基因 PBCV-1 DNA连接酶基因 编码HK97家族噬菌体蛋白基因 caudovirus前体蛋白酶和phcA基因 hypothetical protein Bmul_0496基因

  32. 典型代表菌株 生长曲线 紫外扫描 胞外蛋白差异 • 上清液：培养48 h菌液，取一定量于1000 r/min离心15 min。 • 各取30 μL 原液和上清液与等量样品缓冲液混合，沸水浴3 min，取30μL点样。 • 考马斯亮蓝法和银染法。 • 培养24 h菌液取100μL 转接至25 mLSPA培养基，30℃ ， 170 r/min培养48 h • 取5 mL于5 000 r/min下离心10 min，于190-1100 nm波长扫描，CK为未接菌SPA • 培养24 h菌液转接至120 mLSPA培养基，30℃，170r/min • 每隔2 h测OD，共测34 h，波长600 nm，CK为SPA培养基 三、研究内容 4、青枯雷尔氏菌的生理生化测定

  33. 三、研究内容 4、青枯雷尔氏菌的生理生化测定 • 生长曲线测定 强致病力菌 无致病力菌 过渡型菌 “S”型，不同阶段不同致病性菌生长速率有所不同。 0-8 h，基本一致 8-32 h，强致病力菌最快 32 h-34 h，不同致病性青枯雷尔氏菌基本趋于稳定。 <32 h 8-32 h 0-8 h

  34. 三、研究内容 4、青枯雷尔氏菌的生理生化测定 • 紫外扫描 强致病力菌 292 nm 过渡型菌 297 nm 无致病力菌 304 nm 吸收峰位置，随着菌的致病性不断增强，其最大吸收峰不断蓝移。 吸光度的值，随着菌的致病性不断增强，其吸光度值不断增大，其中强致病力菌>过渡型菌>无致病力菌。

  35. 200 200 KDa KDa KDa KDa 116 116 200 200 97.2 97.2 116 116 97.2 97.2 66.4 66.4 66.4 66.4 44.3 44.3 44.3 44.3 29.0 29.0 14.3 14.3 29.0 29.0 14.3 14.3 三、研究内容 4、青枯雷尔氏菌的生理生化测定 • 胞外蛋白的差异分析 上清液条带十分模糊 菌液条带比较清晰，结果没有显著差异 考马斯亮蓝法 菌液 上清液 强致病力菌，过渡型菌：44.3 KDa、20 KDa、40 KDa和55 KDa有带； 强致病力菌：29 KDa有2条清晰条带，过渡型菌未能出现清晰条带。 银染法 无致病力菌 强致病力菌 过渡型菌 菌液 上清液

  36. 四、结论与展望 （1）共鉴定出85株青枯雷尔氏菌，弱化指数分析结果可分为3大类群，致病性检测的结果符合弱化指数分类的结果。 （2）青枯雷尔氏菌遗传分化与寄主作物和地理来源都存在相关性。其中BOX-PCR可用于检测地域性的差异，REP-PCR可用于检测寄主间的差异。 （3）无致病力菌的phcA基因中插入了一段2032 bp的ISRso21序列，可导致phcA基因发生一定变化。该插入序列在青枯雷尔氏菌中首次发现。 （4）编码共合体决定蛋白T基因、甲基转移酶、整合酶催化基因、依赖DNA的RNA聚合酶基因、PBCV-1 DNA连接酶基因、编码HK97家族噬菌体蛋白基因、caudovirus前体蛋白酶和hypothetical protein Bmul_0496基因在致病力上有可能起着重要作用，为青枯雷尔氏菌致病力进一步研究提供方向。 （5）不同致病性菌生长曲线有所差异，不同致病性菌吸收峰位置、吸光值和胞外蛋白均有显著性差异。

  37. 五、发表论文 • 林海云, 车建美, 刘波, 郑雪芳, 肖荣凤. 基于BOX-PCR和REP-PCR技术青枯雷尔氏菌遗传多样性分析[J]. 农业生物技术学报, 2011, 19(6): 1099-1109. • 林海云,车建美, 刘波, 郑雪芳, 唐唯其, 朱育菁. 青枯雷尔氏菌致病性机制及其相关基因的研究进展[J]. 福建农业学报, 2011, 26(5): 899-906.

  38. 六、致 谢 • 首先向导师刘波研究员及关雄教授致以崇高的敬意和由衷的感谢！在研究生三年的学习生涯中，导师们的渊博知识、求实作风、严谨态度和大胆创新，让我受益匪浅。 • 由衷感谢车建美博士在本试验过程中给予的很大帮助。在与车老师讨论过程中，她对试验过程提出了很多建设性的意见，使得论文顺利完成。同时，很感谢唐唯其师兄在本试验过程中给予的帮助。 • 感谢实验室工作人员朱育菁、蓝江林、郑雪芳等对试验以及论文写作的指导，她们为论文完成提供了巨大的帮助。同时要感谢福建农业科学院全体同学对我的无私帮助，使我得以顺利完成论文。 • 最后，特别感谢我的家人在研究生三年中给予的支持和鼓励。在他们的支持和鼓励下，让我得以顺利走完这三年学习生涯。

  39. 谢谢！

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