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第七章 干细胞研究及其应用

第七章 干细胞研究及其应用. 山东师范大学生命科学学院. 2000 年十月发生在美国 Colorado 的一个故事. In early October, a Colorado couple has a baby named Adam, whose umbilical cord stem cells could cure his six-year-old sister Molly's Fanconi anemia. One cell is removed from an eight-cell embryo in preparation

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第七章 干细胞研究及其应用

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Presentation Transcript

  1. 第七章 干细胞研究及其应用 山东师范大学生命科学学院

  2. 2000年十月发生在美国 Colorado的一个故事 In early October, a Colorado couple has a baby named Adam, whose umbilical cord stem cells could cure his six-year-old sister Molly's Fanconi anemia.

  3. One cell is removed from an eight-cell embryo in preparation for preimplantation genetic diagnosis.

  4. Two separated blastomeres subjected to FISH analysis to check the chromosomes

  5. Genetic abnormalities detected with Vysis Inc.'s MultiVysion PGT technology.

  6. 一、干细胞的概念 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。

  7. 干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域，1999年干细胞研究被美国《科学》杂志评为1999年度世界十大科学之冠，2000年干细胞研究再次被《科学》杂志评为该年度世界十大科学成就之一。 组织工程是以干细胞研究为基础发展起来，它有望解决临床上急需的人工组织与器官问题，进展极为迅速，已经成为干细胞应用的主要方向。

  8. 干细胞有几个主要特征 • 干细胞本身不是终末分化细胞； • 干细胞能无限增殖分裂； • 干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止 状态； • 干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运——保持为 干细胞 或分化为特定细胞。

  9. Alternative models for stem cell development. (A) Invariant asym- metry. A stem cell (S) gives rise by asymmetric division to a prog- enitor (P) with a more restricted proliferation potential, which differentiates in response to extri- nsic cues. The stem cell phenotype is regulated by reciprocal short- and/or long-range signaling (thick colored arrows). (B) Populational asymmetry. Stem cells give rise to daughter cells that can be either stem cells or else progenitors that differentiate along different pathways (1, 2, and 3) depending on the combination of extrinsic factors to which they are exposed. ECM, extracellular matrix.

  10. 1981年Evans和Kaufrnan及Martin首次由小鼠中分离得到鼠的胚胎干细胞。 至今已分离得到的胚胎干细胞物种有： 金黄地鼠（1988）、貂（1993）、猪（1994，1997）、鸡（1996）、恒河猴（1995）、绒猴（1996）。 分离得到人的胚胎干细胞（1998）， 分离得到人的胚胎生殖细胞（1998）， 目前不断报道成年组织来源的的干细胞。

  11. 二、干细胞的分类 按分化潜能大小来分类: • 全能干细胞（ Totipotent stem cell）： 它具有形成完整个 体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞。 • 多能干细胞（ pluripotent stem cell），具有分化出多种组 织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育 潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例 子，它可分化出至少十二种血细胞。 • 专能干细胞（ multipotent stem cell），这类干细胞只能向 一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织 基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。

  12. 根据来源来分: 来源于胚胎--- 胚胎干细胞 ESC （Embryonic Stem Cell ） 胚胎性生殖细胞 EGC （Embryonic Germ Cell ） 来源于成体--- 成体组织来源的干细胞 ASC （Adult-derived Stem Cell ）

  13. 根据干细胞组织发生的名称进行分类: • 胎胎干细胞 • 造血干细胞 • 骨髓间质干细胞 • 肌肉干细胞 • 成骨干细胞 • 内胚层干细胞 • 视网膜干细胞 • 胰腺干细胞

  14. 三、胚胎干细胞

  15. 1998年美国有两个小组分别培养出了人多能( pluripotent )干细胞： • James A. Thomson在 Wisconsin大学领导一个研究小组从人胚胎组织中培养出了干细胞株。他们使用的方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取 inner cell mass细胞，建立细胞株。经测试这些细胞株的细胞表面 marker 和酶活性，证实它们就是胚胎干细胞。用这种方法，每个胚胎可取得15－20个细胞用于培养。 • John D. Gearhart在 Johns Hopkins大学领导另一个研究小组也从人胚胎组织中建立了干细胞株。他们的方法是：从受精后5－9周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞( primordial germ cell )。由此培养的细胞株，证实具有全能干细胞的特征。

  16. Induced differentiation of human ES-derived cells in culture.

  17. ES细胞的体外培养 （取自干细胞和发育生物学， 叶鑫生等编，2000.4）

  18. Pluripotent murine embryonic germ cells identified by red staining

  19. A phase contrast image of the pluripotent murine embryonic germ cell

  20. A culture dish containing hundreds of colonies of murine embryonic germ cells. Each red-stained spot represents an individual colony comprised of hundreds or thousands of stem cells.

  21. 1. ES细胞的全能性主要体现在以下几方面： ①形成畸胎瘤。将ES细胞注人同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚层细胞； ②形成类胚体。培养ES细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞数目。能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种系混杂的集合体、具有三个胚层组织； ③直系分化。通过控制ES细胞生长环境，或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因NeuroD2和NeuroD3转人ES细胞，可使之分化为神经细胞； ④形成嵌合体。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体（chimera），ES细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细胞系是否为ES细胞的标准。

  22. 2. ES细胞生物学特性 细胞形态结构及核型 细胞的高度分化潜能 碱性磷酸酶的表达 胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达

  23. ES细胞形态结构及核型 1. 各种动物的ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。 2. ES细胞与卵圆柱期（egg cylinder stage）胚胎外胚层和胎儿生殖峙的原始生殖细胞类似，而与 ICM细胞有差异。 3. 细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了整倍体性质。正常ES细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。 4. ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。 5. ES细胞增殖迅速，每18—24 h分裂增殖 1次。 6. 此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。

  24. ES细胞的高度分化潜能 ES细胞的全能性是其区别于成 纤维细胞等体细胞的显著特点 1. ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分 化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。 2. 在单层培养时细胞自发分化成多种细胞， 悬浮培养中： “简单类胚体”“囊状胚体” 细胞分化物。 3. ES细胞可进行诱导分化 *用RA（维生素A酸或视黄酸）作诱导90％以上的ES细胞 分化为神经胶质细胞， *聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩 的心肌细胞。 *将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞 组成可代表3个胚层细胞。 *用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重 构胚和动物个体。

  25. 碱性磷酸酶的表达 许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小鼠的EC细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。因此，AKP常用来作为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一。

  26. 胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达 早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA－1）。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、EC细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA－1的表达。小鼠SSEA－1的表达自8一细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚ICM细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，SSEA也常作为ES细胞鉴定的一个标志。

  27. 3. ES细胞的鉴定 -- 细胞的形态结构 -- 核型分析 -- 碱性磷酸酶（AKP）染色 -- SSEA-I 免疫荧光标记 -- 分化能力检测 体外分化试验 体内分化试验 嵌合体形成试验 核移植试验

  28. ES细胞形态学鉴定 依ES细胞的形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁）和生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）对ES细胞进行初步鉴定。

  29. 核型分析 ES细胞具有正常二倍体核型， 可用核型分析进行检验

  30. 碱性磷酸酶（AKP）染色 *常用快绿（Fast Green Staining)染色法， *对照以已建系ES细胞（或小鼠的脱带桑椹胚 或囊胚）作为阳性对照， *作用液中不含α-萘酚磷酸钠为阴性对照。 *结果判定阳性对照ES细胞染成棕色，阴性对 照无色。小鼠3．5日龄胚胎ICM为强阳性。

  31. SSEA-I 免疫荧光标记 第1抗体，SSEA－1（鼠抗ES细胞单克隆抗体），1:100稀释；第2抗体，羊抗鼠 1：10稀释;封闭液，羊抗兔lgG。 步骤①杜氏PBS洗3次,2％Triton作用20 min； ②再以杜氏PBS洗3次,封闭液中置20min； ③以杜氏PBS洗3次，加第1抗体于4℃过液； ④以杜氏PBS洗3次，加第2抗体于30℃温箱置30min； ⑤再以杜氏PBS洗3次后用甘油PBS封片。 样本在激光共聚焦图像系统下观察, 结果依细胞是否出现荧光作出判断。

  32. 分化能力检测 体外分化试验 体内分化试验 嵌合体形成 核移植

  33. 4.胚胎干细胞的制备 1. 直接由动物体内获取囊胚再分离ICM的方法，这样得到的囊胚数量少，质量也可能不高，由此会影响分离ES细胞的效率。 2. 卵细胞去核培养、转入体细胞核，体外培养，获得高质量的去透明带囊胚，由此囊胚进一步分离得到胚胎干细胞。

  34. 目前已证明，小鼠、兔、羊。猪、牛等多种动物的桑目前已证明，小鼠、兔、羊。猪、牛等多种动物的桑 椹胚以前以及囊胚的ICM细胞具有发育的全能性，因 此桑胚胚或囊胚成为分离ES细胞的常用材料。 ES细胞的分离 早期胚胎的获取及处理方法 原始生殖细胞的获取 分化抑制物的选择, 包括：饲养层（feeder lopr）， 条件培养基（conditioned medium， CM） 和分化抑制因子（differentiation inhibitory activity， DIA） 基础培养基的选择 添加物的选用

  35. 5.目前胚胎干细胞的研究 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）也可被称为多能干细胞（pluripotent stem cell，PSC），是胚胎或原始生殖细胞经体外抑制分化培养后筛选出的具有发育全能性的细胞。其可以定向诱导分化为几乎所有种类的细胞，甚至形成复杂的组织和器官，其建系、体外扩增、定向诱导分化、调控机制、细胞性能、组织重构等方面的研究将在未来的人体发育、基因功能、药物开发、细胞治疗和组织器官替代治疗中发挥重要作用，并成为组织器官移植的新资源

  36. ES细胞的应用前景及面临的难题 1．ES细胞的应用前景 （1）ES细胞在动物克隆及人类治疗性克隆中的应用 （2）在转基因动物中的应用 （3）制备嵌合体动物

  37. 2．ES研究面临的难题 （1）体外培养ES 细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分化状态。如何平衡这一对矛盾, 必须筛选适宜的培养条件。目前在ES细胞研究中存在着建系成功率也不高等问题, 只在小鼠中建立了稳定的ES细胞系，家畜、人类细胞系建立的最佳条件仍无定论。

  38. （2）ES 细胞高度未分化, 具有形成畸胎瘤的可能性, 因此在使用ES 细胞进行治疗前必须首先体外诱导ES 细胞分化产生某种特异的组织细胞或设计自杀基因, 当移植的细胞向肿瘤发展时, 自杀基因能启动自毁机制使其凋亡。但如何诱导ES细胞定向分化成单一类型的分化细胞, 是至今仍未解决的难题。因此，必须寻找各种细胞定向诱导分化的条件和方法，以及不同干细胞的表面标志和分选技术，从而得到所需要的细胞或组织。

  39. （3）ES细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破，因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程, 很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。即便是发育完整的来自自然机体的器官, 要离体培养并维持其正常的生理功能目前还无法做到, 器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。

  40. （4）最大的障碍来自于伦理学问题，特别是ES细胞应用受到伦理、法律、宗教以及社会因素的强烈反对，有些国家甚至明令禁止进行人类ES细胞研究。无论从基础研究角度来讲还是从临床应用方面来看，人类ES细胞带给人类的益处远远大于在伦理方面可能造成的负面影响，但随着观念的改变，人们会逐渐认识到ES细胞对临床医学及生物学理论研究的重要作用。

  41. 四、成体干细胞

  42. 目前研究的成体干细胞 （Adult Stem Cells） Bone Marrow Heamatopoietic Stem Cells( HSC ) Peripheral Blood Stem Cells ( PBSC ) Fetal Liver Stem Cells Umbilical Cord Blood Stem Cells Neural Stem Cells “Studies suggest that stem cells in different adult tissues may be more similar than previously thought and perhaps in some cases have a developmental repertoire close to that of ES cells. ”Science, Volume 288, Number 5471, Issue of 2 Jun 2000, pp. 1660 - 1663

  43. 造血干细胞 Hematopoietic Stem Cells，HSC，

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