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分子生物学实验

分子生物学实验. 苏州科技学院化学与生物工程学院. 实验一. 植物基因组 DNA 的提取. 一、实验目的. 通过本实验学习从植物中提取 DNA 的方法。. 二、实验原理. 利用液氮对植物组织进行研磨，破碎组织与细胞。 细胞提取液中的 SDS 溶解膜蛋白破坏细胞膜，蛋白质变性沉淀。 EDTA 抑制 DNA 酶的活性。 利用酚、氯仿抽提去除杂蛋白。 冷乙醇沉淀 DNA 。 冰浴或 65℃ 水浴有利于抑制 DNA 酶的活性。. 三、仪器与试剂. 1 、仪器：低温离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。

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分子生物学实验

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Presentation Transcript

  1. 分子生物学实验 苏州科技学院化学与生物工程学院

  2. 实验一 植物基因组DNA的提取

  3. 一、实验目的 • 通过本实验学习从植物中提取DNA的方法。

  4. 二、实验原理 • 利用液氮对植物组织进行研磨，破碎组织与细胞。 • 细胞提取液中的SDS溶解膜蛋白破坏细胞膜，蛋白质变性沉淀。 • EDTA抑制DNA酶的活性。 • 利用酚、氯仿抽提去除杂蛋白。 • 冷乙醇沉淀DNA。 • 冰浴或65℃水浴有利于抑制DNA酶的活性。

  5. 三、仪器与试剂 1、仪器：低温离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。 2、试剂：细胞提取液，酚/氯仿，乙醇，TE等

  6. 四、实验步骤

  7. 实验流程 2.液氮中研磨成粉，转移至1.5ml EP管中 1.取1g新鲜幼嫩植物叶片 3.加入裂解液600ul，酚60ul，氯仿600ul 4.轻轻混匀，置于65℃水浴20min 5.12000rpm，15min 6.取上清，加入等体积酚/氯仿，混匀 7.12000rpm，5min

  8. 水相，酚相 蛋白质 有机相

  9. 8.取上层水相，加两倍体积的冷乙醇，1/10体积NaAc8.取上层水相，加两倍体积的冷乙醇，1/10体积NaAc 9.冰浴静置约20min 10.12000rpm，5min 11.弃去上清，取沉淀，用70%乙醇洗三次 12.稍干燥，用50ul TE溶解（65℃） 13.上样电泳

  10. 琼脂糖凝胶电泳

  11. 注意：EB具有强致癌性 14. EB 染色

  12. 15.凝胶成像观测实验结果

  13. 注意事项 • 操作时，动作尽量轻柔，避免机械剪切力引起的DNA断裂。 • 操作过程中注意防护，避免受到伤害，包括液氮、酚、氯仿、EB等化学药品。

  14. 实验二 植物基因组总RNA的提取

  15. 一、实验目的 通过本实验学习从植物中提取总RNA的方法。

  16. 利用液氮对植物组织进行研磨，破碎组织与细胞。利用液氮对植物组织进行研磨，破碎组织与细胞。 利用异硫氰酸胍作为强变性剂，破坏内源性RNase、多糖、蛋白质。 利用DEPC抑制外源RNase活性。 利用酚、氯仿抽提去除杂蛋白。 异丙醇沉淀RNA。 冰浴或65℃水浴有利于抑制DNA酶的活性。 二、实验原理

  17. 1、仪器：低温离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。1、仪器：低温离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。 2、试剂：异硫氰酸胍，DEPC，酚/氯仿，异丙醇，TE等 三、仪器与试剂

  18. 四、实验步骤

  19. 1.取1g新鲜幼嫩植物叶片 实验流程 2.液氮中研磨成粉，转移至1.5ml EP管中 3.加入变性液600ul，NaAc 60ul，混匀 4.加入600ul酚/氯仿/异戊醇，震荡，冰浴15min 5.4℃，12000rpm，10min 6.取上清，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃，30min 7.4℃，12000rpm，10min

  20. 水相，酚相 蛋白质 有机相

  21. 8.弃上清，沉淀稍干燥，重新溶于200ul变性液（中途可在65℃热激10s）8.弃上清，沉淀稍干燥，重新溶于200ul变性液（中途可在65℃热激10s） 9.加入20ulNaAc混匀，冰浴静置约20min 10.加入600ul酚/氯仿/异戊醇，震荡，冰浴15min。12000rpm，20min 11.上层水相加入1/10体积NaAc，二倍体积异丙醇混匀，-20℃，1hr 12.12000rpm，20min 13.弃去上清，取沉淀，用70%乙醇洗三次 14.稍干燥，用50ul DEPC水溶解 15.上样电泳

  22. 琼脂糖凝胶电泳

  23. 注意：EB具有强致癌性 16. EB 染色

  24. 15.凝胶成像观测实验结果

  25. 注意事项 本次试验重要的是防止内源性和外源性RNase酶对RNA的降解作用。 注意带好口罩、手套等防护设备。 操作过程中注意防护，避免受到伤害，包括液氮、酚、氯仿、EB等化学药品。

  26. 实验三 PCR扩增

  27. 一、实验目的 通过本实验学习从用PCR的方法扩增目的基因。

  28. 实验四 SDS-PAGE测定蛋白质的分子量

  29. 一、实验目的 通过本实验学习SDS-PAGE测定蛋白质的分子量。

  30. 二、实验原理

  31. 电泳的一般原理 带电粒子在电场作用下，朝向与其本身所带电荷相反的方向泳动的现象。

  32. 制胶原理 AP Acr + Bis PA TEMED In general, use a 5% gel for good resolution in 50-200 kDa range, 10% for 15-75 and 15% for 10-35. Gradient gels (4-15 or 20%) 胶的浓度取决于Acr和Bis的浓度

  33. 制胶流程

  34. 分离原理 一、四个不连续性 1. pH不连续 2. 缓冲液离子成分不连续 • 凝胶孔径不连续 • 电势不连续

  35. 分离原理 二、三种物理效应 • 浓缩效应 • 分子筛效应 • 电荷效应

  36. SDS的作用

  37. 1、仪器：低温离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。1、仪器：低温离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。 2、试剂：上游引物、下游引物、Taq酶、dNTP、模板等 三、仪器与试剂

  38. 四、实验步骤

  39. 制胶

  40. 样品制备及处理

  41. 电泳

  42. SDS-PAGE电泳仪

  43. 琼脂糖凝胶电泳

  44. 考马斯亮蓝染色

  45. 凝胶成像观测实验结果

  46. 注意事项 丙烯酰胺在聚合之前有神经毒性，聚合之后毒性消失。 过硫酸铵需当天配制。 注意带好口罩、手套等防护设备。

  47. 聚合酶链式反应（PCR）的原理类似于天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA特异性扩增2n倍。聚合酶链式反应（PCR）的原理类似于天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA特异性扩增2n倍。 二、实验原理

  48. 1、仪器：低温离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。1、仪器：低温离心机，恒温水浴器，琼脂糖电泳系统，凝胶成像分析系统。 2、试剂：上游引物、下游引物、Taq酶、dNTP、模板等 三、仪器与试剂

  49. 四、实验步骤

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