Analisi comparativa di E2 a seq e struttura nota

1. Analisi comparativa di E2 a seq e struttura nota

2. no details available on precise configuration of the E2 active sites and reaction mechanisms • transfer of Ub/Ubl from E1 and E2 involves a nucleophilic attack by the E2 cys on the carbonyl group of the Ub/Ubl-E1 thioester linkage. Experiments suggested that this reaction is primarily catalyzed by residues on the E1 protein in addition to the E2 cys. • Studies on ubiquitinating and sumoylating E2 enzymes, Ubc13 and Ubc9, indicate that the target lysine makes a nucleophilic attack on the carbonyl group of the Ub/Ubl-E2 thioester linkage upon deprotonation. • 3 residues (asparagine, tyrosine, aspartate) proposed to mediate localization of the target lysine and act to lower the effective pKa of the active site to allow the lysine’s deprotonation • For Asparagine also proposed to stabilize an oxyanion formed in the reaction intermediate during the nucleophilic attack • generality of E2 function and other aspects of the mechanisms • of Ub transfer and role of E2 in target specificity poorly understood. • identification of prokaryotic homologos of the E2 enzymes • existence of UEVs (catalytically inactive E2-like)

3. evolutionary info from bacterial E2 homologs in conjugation with the new crystal structures to explore previously unknown aspects of E2 catalysis and biochemical function. • they performed a comprehensive comparative analysis of the E2 superfamily, indentifying all structural and sequence variations.

4. IDENTIFICAZIONE SEQUENZE/STRUTTURE E2 • diverse strategie di ricerca per similarità per identificare tutti i membri noti con fold E2 • ricerca strutturale: a partire da set strutture rappresentative del fold E2 da database SCOP e ricerca iterativa all’interno di PDB usando programma DALI (e valutando le strutture 2D con DSSP) • Le seq di ogni rappresentante strutturale cosi’ identificato sono state usate come query per ricerche con PSI-Blast (si basa sul metodo dei profili) alla ricerca di tutte le sequenze note di E2-like (ricerca iterata fino a convergenza con E-value < 0.01) • i match positivi con PSI-Blast ulteriormente usate come sonda per ricerche con altri metodi ad es. basati su HMM (Hidden Markov Model) sempre per le ricerche di similarita’ in banche dati • il set completo di sequenze sono clusterizzate e classificate in “famiglie” basandosi su caratteristiche strutturali e pattern di sequenze conservate ben specifici. • allineamento strutturale tra tutte strutture note • allineamento di sequenza tra tutte le famiglie di domini E2 e corretti sulla base degli allineamenti strutturali • [Figure 1]

5. 16 famiglie: 11 eucariotici (4 non cat. attive) 5 procariotiche (1 non cat. attiva) Delle 12 cat. attive a parte cys nessuno dei residui Funzionalmente importanti indicati dagli studi di Ubc9 e Ubc13 sono apparentemente conservati .

6. The ASN residue implicated in positioning the lysine and stabilizing the oxyanion conserved in 4 families

7. The tyrosine only in 3 families (in other hydrophobic) The aspartate only in some members

8. The proposed additional residues of the E2 active site are not a general feature of E2 catalysis Usano allineamenti multipli di sequenza – e allineamenti strutturali per studiare evoluzione del sito attivo nella superfamiglia di E2. Per prima cosa identificano caratteristiche di struttura e sequenza conservate nel fold e usate come baseline per studiare le “innovazioni” in ciascuna famiglia.

9. CORE STRUCTURE (E2) 4-strand beta-meander che ricorda una delle parti (blade) in cui è organizzato un beta-propeller + altri aspetti strutturali distintivi del fold E2 rispetto ad altre 4-strand beta-meander Beta propeller Un motivo strutturale molto semplice è quello composto da due o più filamenti consecutivi antiparalleli, legati insieme da un hairpin. Tale motivo, definito β-meandro (dal termine meander)

10. CORE STRUCTURE (E2) • 4-strand beta-meander che ricorda una delle parti (blade) in cui è organizzato un beta-propeller + altri aspetti strutturali distintivi del fold E2 rispetto ad altre 4-strand beta-meander • C-terminal flap-like structure that contains within it two small elements in extended conformation forming a Beta-harpin • helix 1 at N-terminus and 1-2 helix C-terminal. • flap like structure coinvolta in cambiamenti conformazionali in seguito a interazione con Ub/Ubl (legami a idrogeno) Cys catalitica sempre al c-terminal del flap

11. ACTIVE SITE CONFIGURATION Cys catalitica sempre al c-terminale del flap Famiglie in cui ASN conservata (flap asn) hanno anche HIS conservata (flap his) (motivo HxN). Tyr cons solo in alcune famiglie (in altre idrofobico) suggerito far parte del sito attivo in Ubc9, da studi di co-cristallizzazione si vede essere all’interfaccia con il substrato target Hp scarsa conservazione tyr perché forse implicata nel riconoscimento del target (non riportata nel diagramma strutturale riassuntivo)

12. CARATTERISTICHE CONSERVATE nel FOLD Studio estensivo di allineamenti di sequenza e struttura mettono in luce altri residui, oltre alla cys che sono altamente conservati in tutto il fold (incluse le famiglie batteriche) PRO a N-terminale strand 4 e suo partner di interazione idrofobico (trp/met) tra flap e elica 2a Int. conservata anche nelle UEV (non cat. attivi) -> ruolo strutturale Residuo aromatico sia in versioni attive che non attive nel loop tra strand 2 e 3. E’ in un cluster di residui che hanno molte interazioni tra loro e, secondo gli autori, potrebbe avere un ruolo di connessione tra il flap e il beta-sheet e per permettere cambiamenti conformazionali durante la catalisi

13. CONFRONTO TRA RESIDUI SULLA SUPERFICIE • trovano in tutti E2 cat. Attivi due tasche di legame: • Una su ogni lato del β-sheet e sono ricchi di aa idrofobici conservanti intra-famiglia. • il solco dalla parte del β-sheet che è impaccato verso le α-eliche, interagisce con coda C-term di Ub/Ubl • Cys cat in Ubc6-like e APG3/APG10-like è al centro di questa tasca, per altri E2 piu’ vicina alla parte terminale. • Associazione di cys e questa tasca di legame suggerisce suo ruolo nel legare coda Ub/Ubl sia caratteristica ancestrale della super-famiglia E2.

14. CONFRONTO TRA RESIDUI SULLA SUPERFICIE • - Ruolo dell’altra tasca meno chiaro ma alcune strutture suggeriscono possa essere implicato nell’interazione con E1 durante trans-tio-esterificazione. • La conservazione della seconda tasca suggerisce che interazione con E1 sia un’altra potenziale caratteristica ancestrale del fold E2.

15. VARIAZIONI STRUTTURALI • Molte variazioni strutturali famiglia-dipendenti che altera l’architettura locale del sito attivo • ad esempio in APG3/10 che sono E3-indipendenti. Hanno un inserzione di α-elica nella porzione N-terminale del flap e hanno flap piu’ lungo di altri E2 – no β-harpin ma strand aggiuntivi al β-meander e di conseguenza cisteina cat non è piu’ in posizione equivalente ad altri E2. Tale localizzazione non permette interazioni con flap HIS. Infatti NxH non è conservato. • Questa famiglia ha pero’ un’altra HIS conservata che interagisce con la cys

16. VARIAZIONI STRUTTURALI • Famiglia Ubc6-like: ha inserzione di 3 aa nel flap a valle della cys catalitica. • il β-harpin si riorganizza a causa di network Hbond tra questa regione e loop tra le due eliche in C-term • conseguenze sulla localizzazione della cisteina catalitica • manca di HxN • ha un’altra HIS 7 aa a valle della cys conservata nella famiglia Ubc6

17. VARIAZIONI STRUTTURALI • Famiglia UbcI: molte interconnesse variazioni • regione N-term del flap a monte β-harpin espesa e interagisce con un’altra regione tra le due eliche C-terminali • causa cambiamenti sulla conformazione del flap harpin con la cisteina catalitica piu’ verso l’esterno e impedisce interazione tra flap harpin e elica C-term • manca HxN • ha una HIS conservata al C-terminale dell’elica 2b • che occupa posizione spazialmente corrispondente alla flap asn e un residuo di glu due residui a valle della cys fa ponte salino con questa his aiutando a mantenerne l’orientamento

18. VARIAZIONI STRUTTURALI • Famiglia cataliticamente non attiva RWD e’ la piu’ divergente – il flap ha struttura alpha-elica • conserva pero’ residui idrofobico tra flap e elica 2a, e prolina conservata con cui interagisce, suggerendo che quest’elica famiglia-specifica derivata dal flap e la transizione strutturale sia stata favorita dalla perdita di attivita’ catalitica

19. VARIAZIONI IN SEQUENZA CHE INFLUENZANO PROPRIETA’ del sito attivo • Ufc1-like: mancano sia flap H che flap N – ha LYS conservata il cui gruppo carbonilico del backbone interagisce con la cys catalitica e un residuo di TRP in cui atomo N dell’anello indolico si porta vicino al carbonile della LYS e sono reminescenza insieme della flap N • Anche altre differenze in altre famiglie riguardano sempre la flap ASN e HIS Le famiglie batteriche cataliticamente attive conservano o HxN o almeno N Ci sono UEV (Tgs101) che conservano occasionalmente flap HIS o ASN e anche l’architettura generale del sito attivo, anche se perdono la cys e sono note legare Ub.

20. COMUNICAZIONE TRA SITO ATTIVO E β-meander • Residuo aromatico nel loop tra strand-2 e 3 -> analisi sistematica tutti i suoi partner di interazione nelle strutture note e loro conservazione • Se flap HIS è presente interagiscono • Dato che flap HIS interagisce con flap ASN e questa con CYS questi residui formano una catena di residui interagenti che connette il sito catalitico al β-meander • E’ conservato anche nelle famiglie che hanno variazioni strutturali che fanno si che i residui equivalenti a flap HIS e ASN siano in altre posizioni o di altra natura – esiste sempre questa catena di residui interagenti tra loro

21. IMPLICAZIONI PER IL MECCANISMO CATALITICO • La presenza di tasche di legame conservate suggerisce stesso modo di interagire con Ub/Ubl • Conservazione del flap e suoi cambiamenti conformazionali in seguito a interazione con Ub/Ubl suggeriscono suo ruolo generalizzato nel meccanismo di azione degli E2 • L’interazione conservata pro-idrofobico da un lato e la catena di residui interagenti dall’altro potrebbe avere un contributo nell’interazione con Ub/Ubl. Permettono che si creino/rompano interazioni deboli es. legami a H alternativamente intramolecolari se manca l’Ub o con l’Ub. • E2 caso eccezionale di “evoluzione enzimatica”: cys unico residuo necessario e sufficiente alla catalitisi e che puo’ variare in termini di posizione spaziale in diverse famiglie rispetto allo scaffold comune del fold. In accordo con il fatto che esistono pochi vincoli all’intorno in cui la cys si trova. • Un gruppo polare con funzione analoga alla flap ASN sembra essersi evoluto in modo convergente in posizioni spaziali corrispondenti rispetto alla cys catalitica. • Flap HIS: switch che passando da forma protonata a non possa regolare l’ASN (acido/base)

22. IMPLICAZIONI PER IL MECCANISMO CATALITICO • A corollary to observation that there is a whole range of family-specific innovations in the region around the active cys is that it could play a role in target specificity (osservazione supportata da alcune strutture note in complesso con i substrati) • in alcuni casi persino sottili sostituzioni aa possono avere un ruolo nel determinare specificita’ di substrato (es. confronto Agp3 e Agp10- hanno thr o his conservata 2 aa a monte cys e riconoscono substrati diversi)