Protein purification

Protein purification Chromatography Methods 1. Ion-exchange chromatography : 단백질이 특정 pH에서 charge를 가지고 있는 것을 이용하는 방법이다. (Anion-exchanger, Cation-exchanger) 2. Gel filteration chromatography : 단백질의 size의 차이를 이용하는 방법이다. 3. Hydrophobic Interaction chromatography : 단백질의 소수성을 이용한 방법이다. 4. Affinity chromatography : 단백질이 특정 물질과 binding 하는 성질 이용

1. Ion exchanger chromatography : protein의 극성을 이용한다. Anion exchanger chromatography : pH 7.5 Protein 용출순서 + + - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - _ _ Column에 주입 - - _ _ 1 : unbounded protein _ _ + + + pH 7.5 + + + + + _ _ Protein pH 7.5 2. -2 bounded protein pH 7.5 Concentration Cl- _ _ - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Cl- Cl- Cl- NaCl gradient Concentration 3. -3 bounded protein Cl- Cl- Cl- - - _ _ 주의 : Protein의 charge 상태는 pH에 따라 변할 수 있다. 따라서 자신이 분리하고자 하는 단백질 이외의 것을 가장 많이 제거 할 수 있는 pH의 선택이 중요하다.

Cation exchanger chromatography : pH 7.5 Protein 용출순서 + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Column에 주입 + + + - - _ _ 1 : unbounded protein _ _ pH 7.5 - + + + - _ _ + + - _ _ Protein pH 7.5 2. +2 bounded protein pH 7.5 Concentration Na+ + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Na+ Na+ NaCl gradient Na+ Concentration 3. +3 bounded protein Na+ Na+ Na+ - + + + 주의 : Protein의 charge 상태는 pH에 따라 변할 수 있다. 따라서 자신이 분리하고자 하는 단백질 이외의 것을 가장 많이 제거 할 수 있는 pH의 선택이 중요하다.

실험실에서 보유하고 있는 anion exchanger 1. Source-30Q (strong anion exchangers) Type of gel charged group -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 particle size : 30um, binding capacity : 45 mg/ml gel pH stability 2-12, maximum flow rate (cm/h) : 2000 working flow rate : 300-1000 2. Resource-Q (1ml, 6ml) : source-Q와 특징이 거의 동일하다.

실험실에서 보유하고 있는 cation exchanger 1. Source-30S (strong cation exchangers) Type of gel charged group -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-SO3- particle size : 30um, binding capacity : 45 mg/ml gel pH stability 2-12, maximum flow rate (cm/h) : 2000 working flow rate : 300-1000 2. Resource-S (1ml) : source-S와 특징이 거의 동일하다.

2. Gel filteration chromatography : 단백질의 size의 차이를 이용하는 방법이다. 용출순서 bed의 확대 모양 Gel Bead의 내부는 그물 모양으로 형성되어 작은 protein의 경우 그물을 모두 통과하게 된다. 이러한 이유로 경로가 길어지게 된다. 2 1 3 Protein 길이 : protein의 이동경로 특정한 marker를 사용하면 Protein의 native size를 알 수 있다. column의 크기와 sample의 volume이 중요하다. 소량의 sample만 사용가능 보통 sample volume의 경우 total gel volume의 0.1~1%정도가 적당하다 실험실에 있는 gel 종류 1. Superdex 75(prepacked) optimal MW separation range : 3,000 ~ 70,000 globular protein total gel volume : 24ml, pH stability : 3 ~ 12, Max flow rate : 1.5 ml/min, 2. Superdex 200(column에 충진 시킨 후 사용하여야 함) optimal MW separation range : 10,000 ~ 600,000 globular protein, Max flow rate : 1.0 ml/min

3. Hydrophobic Interaction Chromatography : 단백질의 소수성 특징을 이용하여 분리 정제 하는 방법이다. Hydrophobic ligand NH4+ NH4+ NH4+ NH4+ NH4+ NH4+ NH4+ (SO4)2- (SO4)2- NH4+ High concentration Salt solution ex)1M (NH4)2SO4 (SO4)2- Protein elution used low concentration salt solution (SO4)2- 단백질은 고 농도의 염이 존재 시 Salting Out되는데 이것을 기본으로 하여 단백질을 분리 정제하는 방법 이다. 즉 고농도의 염이 존재하게 되면 단백질의 소수성 부분들이 함께 모이려는 힘이 생긴다. 이때 ligand의 소수성 부분과 단백질이 hydrophobic interaction이 생기게 되고 염의 농도를 점차 줄이게 되면 ligand에 결합되어진 단백질이 용출 되게 된다. 이 방법은 대체로 ion exchange chromatography의 방법으로 별 효과를 얻지 못하는 단백질을 분리 정제하는데 용이 하게 쓰인다. 특히 membrane binding protein의 분리 정제에 효과적이라고 생각 되어 진다. Buffer의 pH와 염의 농도가 분리력에 매우 중요하게 작용한다.

4. Affinity chromatography : 항원 항체, lectin 또는 특정 substrate에 단백질이 binding 하는 성질을 이용 or 2) 4) 5) 1) 3) Affinity chromatography의 경우 매우 specific한 방법이다. 따라서 단백질을 분리 정제 할 때 여러 단계를 거치지 않고 한번에 정제할 수 있는 장점이 있다. 항체를 분리 정제 할 때 많이 사용되며 시료의 확보가 매우 어렵고 그 양이 적을 때 사용하면 매우 효과적이다. 단점은 모든 단백질에 적용되는 것은 아니다. 또한 ligand의 확보가 용이 하지 않다.

Lectin affinity chromatography : 당 단백질 분리 정제에 매우 유용하게 사용된다. 실험실에 있는 종류 : Lectin test Kit 가 있으며 종류는 Concanavalin A, Lentil Lectin, Wheat Germ Lectin, Peanut Lectin등이 있다.

Protein의 확인(Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) 1. Native-PAGE : protein의 변성 없이 전기 영동을 한다. 단백질의 크기, charge, 모양 등이 영향 인자이다. 2. SDS-PAGE : protein의 변성이 일어 나며 단백질의 분자량 을 확인 할 수 있다. SDS의 구조 : CH3(CH2)11SO-3Na+ 2-Mercaptoethanol : HS-(CH2)2-OH 3. 2D-Electrophoresis : 단백질의 pI값과 분자량을 비교 분석 할 수 있는 장점이 있으며 최근의 proteomics에 많이 이용. 4. PAGE상에서의 단백질 Activity 측정

Gel 만들기 wall (-) Alumina plate Stacking gel Spacer (+) Poly Acrylamide Gel Running gel Glass plate Stacking gel : 4% acrylamide 사용, 단백질의 농축 역활 Running gel : 실지적으로 단백질이 분리가 일어 나는 부분, acrylamide %는 필요에 따라 결정 한다.

Stacking gel과 Running gel 사이에서 단백질이 농축 된다. 이유 : pore size차이로 이러한 현상이 일어남 (-) MW와 관계없이 전기 영동 된다. Net charge가 가장 큰 영향을 줌 High MW (+) (SDS-PAGE) Low (Native-PAGE) SDS-PAGE의 경우 분자량에 따라 분리가 일어 난다. 이때 작은 분자량은 이동거리가 더 멀리 나타나게 된다. MW-Marker를 이용하여 Rf값을 구하게 되면 우리가 원하는 단백질의 분자량 을 구할 수 있다. Native-PAGE의 경우 단백질의 변성 없이 전기 영동을 할 수 있다. 따라서 활성을 gel 상에서 확인 할 수도 있다.

2D-Electrophoresis : Protein의 pI값과 M.W.모두 확인 할 수 있다. Marker 1차 적으로 단백질이 pI값에 의해 분리가 일어난다. pH gradient SDS-PAGE를 실시 한다. Protein의 분자량에 따라 분리된다. 단백질에 돌연변이가 생기게 되면 이러한 조건들이 틀려지게 된다. 따라서 이러한 조건을 data base화 시킨 후 이용하고자 하는 학문이 bio information or proteomics이다.

PAGE를 이용한 one-step purification 특정 단백질의 경우 Gel상에서 활성을 측정 할 수 있으며 이것을 이용하여 purification 할 수 있다. 즉 활성을 측정하고 그 부분의 protein만 추출 하게 되면 purification이 되는 것이다. 확산법과 전기 추출법으로 단백질을 분리 할 수 있다. 단백질의 특성을 확인 할 수 있으며 amino acid sequence를 확인 할 수 있다. 단백질 중 그 특징이 매우 비슷한 것이 존재 할 수 있기 때문에 이 방법은 단백질이 많이 존재하는 처음 단계에서 적용하기에는 문제점이 많이 있다. 따라서 어느 정도 분리가 일어나고 그 활성을 측정 할 수 있으며 다른 방법으로 분리 정제하기에 너무 적은 양이나 용이 하지않을때 사용하게 된다.

Chitin은 N-acetyl-D-glucosaminie의 (1,4) 결합으로 이루어 져 있으며 게 새우 등 갑각류의 껍질, 곤충의 큐티클 층, 오징어 같은 연체 동물의 골격과 버섯, 곰팡이의 세포벽 등에 다량으로 존재한다. Chitin NaOH deacetylation Chitosan은 반응기가 좋은 amino group이 존재하며 chitin과 더불어 생리 활성이 높다. 장내세균 생육인자, 인공피부, 생분 해성 포장재 항콜레스테롤, 항균제와 보존재로 사용 가능 하다. 또한 올리고당은 항암제 로 연구되고 있다. Chitosan

Chitinase : chitin의 (1,4)결합을 가수 분해하여 절단하는 효소. Endo chitinase : chitin을 무작위로 분해하여 oligomer를 만든다. Chitinase Exo chitinase : chitin을 끝부분 부터 하나씩 절단하여monormer를 만든다. Chitinase N-acetylglucosaminidase : chitin dimer를 잘라서 monomer를 만든다.

Chitinase의 경우 plant에서는 defense mechanism,seeddevelopment, 꽃의 개화에 관련이 있다고 보고 되고 있으며 2개 이상의 isozyme이 존재한다. 하지만 아직 그 정확은 기능에 대해서는 많은 연구가 필요한 enzyme이다. 또한 plant에서는 chitin의 존재가 아직 발견되지 않았다. 미생물에서는 대부분 영양분 공급을 위해서 사용되어 지며 exochitinase가 많이 존재하고 있다. 곰팡이중 일부는 chitin을 가지고 있기 때문에 chitinase가 존재하는 것은 이상한 일이 아니다. 즉 세포벽 형성에 중요한 역할을 한다고 볼 수 있다. 곤충의 경우 대부분 큐티클 층에 chitin이 존재하기 때문에 성장을 위해서는 chitinase 가 필요하다. 동물의 경우 영양분의 공급을 위해 존재하거나 신호 전달에도 관여하는 것으로 알려지고 있지만 정확한 그 기능은 아직 밝혀지지 않았다. 동물들의 당단백질중 상당한 당들이 N-acetylglucosamine을 보유하고 있는 것으로 알려지고 있으며 N-acetylglucosamine은 chitin을 monomer로 분해 하면 나오는 물질이다. 현재 우리나라는 산업적으로 chitin과 chitosan의 효용가치가 놓아 지고 있는 실정이다. 따라서 다양한 chitin, chitosan을 분해 할 수 있는 enzyme을 연구하는 것은 중요한 일이다. 또한 생체 내에서의 기능에 대해서는 아직 많이 알려지고 있지 않기 때문에 과학적인 접근도 필요한 enzyme이라고 생각 되어 진다.

GradiFrac 구성도 Mixer Column UV-detector Pump Recoder Buffer A Buffer B Fraction collector

실험 목차 1주차 : 설명 단백질 추출 & dialysis에 의한 buffer exchanger 3주차 : Anion exchanger chromatography 4주차 : Cation exchanger chromatography 5주차 : Affinity chromatography 6주차 : 단백질 정량 및 PAGE & chitinase activity 측정

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