ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

1. ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

2. ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ • Η Μοριακή Βιολογία, προϊόν της σύζευξης της Βιοχημείας με τη Γενετική παρέχει μια σειρά μεθόδων με ευρεία εφαρμογή σε όλες σχεδόν τις ιατρικές ειδικότητες και ιδιαίτερα στα λοιμώδη νοσήματα, τα κληρονομούμενα νοσήματα, τον καρκίνο κ.λ.π.

3. Ενότητες • Απομόνωση DNA, RNA • Ηλεκτοφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης • Περιοριστικά ένζυμα • Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης • Κλωνοποίηση, τεχνολογία ανασυδιασμένου DNA • Παραγωγή ανασυνδιασμένων πρωτεινών • Εφαρμογές της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης • Αλληλούχιση DNA μορίων (Sanger Sequencing) • BLAST και εργαλεία στοίχισης DNA αλληλουχιών • Εισαγωγή γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα • Σύνθεση cDNAμορίων • Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR, qRT-PCR) • Μικροσυστοιχίες γονιδίων (Microarrays) • Deep sequencing • Δημιουργία διαγονιδιακών ζώων

4. Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) • Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μέθοδοςπαραγωγής μεγάλου αριθμού αντιγράφων συγκεκριμένων μικρών αλληλουχιών DNA – λογαριθμική αύξηση PCR: 1985, Βραβείο Nobel για τον Kary Mullis in 1993

5. Αναλώσιμα

6. χρησιμοποιείται ένα ζεύγος εκκινητών (primers) που έχουν συμπληρωματική αλληλουχία με τα άκρα του DNA στόχου + MgCl2 + Buffer διάλυμα + dNTPs + Taq polymerase + εκκινητές ηλεκτροφόρηση

7. Ένας χώρος  χρήση θαλάμων βιολογικής ασφάλειας, χρήση απολυμαντικών και UV •Όχι σε χώρο καλλιεργειών μικροοργανισμών! •Χρονικός χωρισμός!

8. Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) • Βασίζεται στην ιδιότητα των αλυσίδων του DNA α) να αποχωρίζονται σε υψηλή θερμοκρασία και να επανενώνονται σε χαμηλότερη θερμοκρασία και β) να αντιγράφονται • Παράγονται εκατομμύρια αντιγράφων

9. PCR απαιτούνται: • Magnesium chloride: .5-2.5mM • Buffer: pH 8.3-8.8 • dNTPs: 20-200µM • Primers: 0.1-0.5µM • DNA Polymerase: 1-2.5 units • Target DNA: 1–10 μg/ml

10. ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ (PRIMERS) • Εκκινητές : 20-30 νουκλεοτίδια  GC = 40-6-% ομοιογενώς κατανεμημένα.

12. Περίπου 104 αντίγραφα DNA απαιτούνται για την ανίχνευση προϊόντος PCR μετά από 25-30 κύκλους αντίδρασης...1–10 μg/ml DNA. • … ↑ DNA + αριθμοί κύκλων ↓ ειδικότητα εκκινητή • Τm  Wallace formula: • Tm = 4x (#C+#G) + 2x (#A+#T) °C • ΜgCl 2  απαραίτητο για την Taq polymerase!!!

13. Κινητική της αντίδρασης της PCR

16. ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ PCR • Αντιδραστήρια PCR • συγκέντρωση Mg++ • συγκεντρώσεις εκκινητών που επιδρούν στην ευαισθησία και ειδικότητα • θερμοκρασίες πρόσδεσης –(annealing)

17. Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης MgCl2 στην PCR. •Εφαρμογή της μεθόδου χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις MgCl2 οι οποίες κυμαίνονταν από 1 mM ως και 3mM

18. Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των εκκινητών •Stock of primers: 100pmol/μl •Υποδιπλάσιες αραιώσεις: 50pmol/μl, 25pmol/μl, 12,5pmol/μl, 6,25pmol/μl και 3,125pmol/μl για κάθε έναν από τους εκκινητές.

19. Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των εκκινητών Π.χ.

20. Βελτιστοποίηση της θερμοκρασίας για την πρόσδεση των εκκινητών •Εφαρμογή της μεθόδου σε εύρος θερμοκρασιών 42-57,5ºC Π.χ.

22. Κλωνοποίηση, τεχνολογία ανασυδιασμένου DNA

26. ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΟΥ DNA 1/2

29. Cloning and selection markers Antibiotics

30. The problem of self ligation -Need for additional selection markers

31. Generation of engineered restriction sites on plasmids on selection markers

32. LacZ, Blue-white selection + INSERT

33. LacZ, Blue-white selection

35. Applications of PCR Basic Research Applied Research • Genotyping • Genomic cloning • Sequencing • Detection of pathogens • Pre-natal diagnosis • Cancer research-Mutation detection • Molecular Epidemiology +Real time PCR +cDNAsynthesis and quantitative RT-PCR

36. Basic Research_Molecular cloning

37. Γονοτυπιση και Ταυτοποίηση γενομικου DNA • Το γενομικό DNA περιέχει πολυμορφικές περιοχές που διαφέρουν μεταξυ των ατόμων. • Οι πολυμορφικές περιοχές περιέχουν αλληλοχίεςμικροδορυφορικου DNA. Το μικροδορυφορικό DNA (ή short tandem repeatsSTR)είναι μικρές, επαναλαμβανόμενες, απλές αλληλουχίες DNA, μήκους 1-6 bp • Οι πολυμορφικές περιοχές πολλαπλασιάζονται με multiplex PCR, και τα παραγόμενα κομμάτια DNA διαχωρίζονται με βάση το μεγεθός τους. Το παραγόμενο μοτίβο (pattern) λειτουργεί σαν πλαίσιο ταυτοποίησης(unique barcode)ενός ατόμου.

38. Short tandem repeat

39. DNA FRAGMENT ANALYSIS STR1 STR2 STR3 STR4

40. DNA-Based Human Identification

41. DNA detection of pathogensΑνίχνευση DNAμε τεράστια ευαισθησία  ανίχνευση ιών κ.α. μικροοργανισμών σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις σε ενα βιολογικό δείγμα • Το PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την μοριακή ταυτοποίηση βακτηριακών • Το PCR μπορεί να ανιχνεύσει γονίδια ανθεκτικότητας των βακτηρίων σε αντιβιοτικά

42. PRC diagnostics Viruses • HIV, SARS, H5N1 Bacteria • meningococcus, legionellosis Analysis for resistant genes • MRSA, VRE RT-PCR can detect specific RNA sequences within a sample. Example: Retroviruses have an RNA genome. Retroviral RNA can be detected by RT-PCR to diagnose retroviral infections.

43. Molecular Identification: Detection Of Pathogens Sensitivity of detection of PCR-amplified M. tuberculosis DNA. (Kaul et al.1994)

44. Mutation detection

45. Sanger Sequencing Genomic PCR amplification

46. Sanger sequencing

48. PCR_ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ

49. cDNA synthesis

50. RECOMBINANT PROTEINS