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产前诊断中绒毛、脐血、羊水取样及标本培养. 南京大学附属鼓楼医院妇产科 产前诊断中心 李 洁 副主任医生 2006 年 11 月. 产前诊断指征. 夫妇任一方有染色体异常; 曾生育过染色体病患者; 夫妇任一方为单基因病患者; 曾生育过单基因病患者; 有不明原因的自然流产史、畸胎史、死产或新生儿死亡史;. 产前诊断指征. 羊水过多的孕妇; 夫妇任一方曾接触致畸因素; 孕妇年龄大于 35 岁; 有遗传病家族史的近亲婚配的夫妇。 产前筛查高风险的孕妇 超声胎儿结构筛查胎儿有结构异常的孕妇. 产前诊断的方法. 羊膜腔穿刺取样( amniocentesis )
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产前诊断中绒毛、脐血、羊水取样及标本培养 南京大学附属鼓楼医院妇产科 产前诊断中心 李 洁 副主任医生 2006年11月
产前诊断指征 • 夫妇任一方有染色体异常; • 曾生育过染色体病患者; • 夫妇任一方为单基因病患者; • 曾生育过单基因病患者; • 有不明原因的自然流产史、畸胎史、死产或新生儿死亡史; 南京鼓楼医院
产前诊断指征 • 羊水过多的孕妇; • 夫妇任一方曾接触致畸因素; • 孕妇年龄大于35岁; • 有遗传病家族史的近亲婚配的夫妇。 • 产前筛查高风险的孕妇 • 超声胎儿结构筛查胎儿有结构异常的孕妇 南京鼓楼医院
产前诊断的方法 • 羊膜腔穿刺取样(amniocentesis) • 绒毛穿刺取样(chorion villus sampling,cvs) • 脐带血取样(periumbilical cord blood sampling,PUBS) • 植入前诊断(preimplantaton genetic diagnosis,PGD) 南京鼓楼医院
产前诊断的方法 • 胎儿组织取样(皮肤、肝脏) • 胎儿镜(fetoscope) • 胚胎镜(embryoscope) • 胎儿超声波图象(fetal ultrasound imaging) • 母体外周血胎儿细胞检测(cell-storing) 南京鼓楼医院
绒毛穿刺取样—历史 • 1975年 我国鞍山钢铁公司铁东医院首次问世(经宫颈盲吸法,准确率95%,自然流产率9.3%,出生婴儿未发现异常) • 莫斯科产科研究所(超声引导下经宫颈吸样) • 1983您 Ward 和 Brambati 分别于英国和意大利发表文章介绍绒毛取样及核型分析 南京鼓楼医院
绒毛穿刺取样—时间 • 妊娠9—11周 南京鼓楼医院
绒毛穿刺取样—抽取量 • 20mg左右 (染色体核型分析约需10mg,DNA分析约需5mg,生化测定约需5-10mg) 南京鼓楼医院
绒毛穿刺取样—并发症 • 胎儿丢失 • 胎儿肢体发育缺陷(LRD) 南京鼓楼医院
CVS并发症—胎儿丢失 • CVS的流产率不比amniocentesis高 • 经宫颈和经腹取样安全性相同(Jackson,1992) • 多胎取样高于单胎取样(Pergament,1992) 南京鼓楼医院
CVS并发症-LRD • 1999年WHO发布CVS综合性资料认为CVS与LRD无关(216,381例CVS中115例出现LRD发生率1:1881,总的人群发生率1:1642) • 世界各地相关资料综合,9周以下CVS出现LRD的机会高,但原因尚不清楚 • CVS不应在小于孕10周的条件下进行 南京鼓楼医院
绒毛穿刺取样—方法 • 经宫颈(transcervical) • 经腹(transabdorminal) 南京鼓楼医院
CVS方法—经宫颈取样 • B超采用高分辨的扇扫式或凸阵式实时超声诊断仪,经腹探头频率3.5MHz,经阴道探头频率5 - 7MHz。 • 采用特制较细的滋养层活检导管(多聚乙烯导管),其塑料导管外径1.4 – 1.6 mm,长20cm,带有导管芯,导管前端稍弯,外形似宫腔探子。 • 导管另一端连接10-20ml含有2-4ml生理盐水的注射器 南京鼓楼医院
CVS方法—经腹取样 • 双针活检系统由1根长15cm、外径1.2mm的18号引导套针,及1根长20cm、外径0.8mm的22号活检针组成。 • 在超声引导下,先将引导套针经腹壁及子宫穿刺入胎盘绒毛边缘部分,拔出针芯,然后将活检针经引导套针内送入胎盘绒毛组织,连接含2-4ml生理盐水的20ml注射器,以5ml的负压上下移动活检针吸取绒毛组织 南京鼓楼医院
CVS注意事项 • 动作要轻柔 • 穿刺部位在胎盘绒毛叶 • 抽吸次数不宜过多 南京鼓楼医院
羊膜腔穿刺—历史 • 1956年 Fucks进行羊膜腔穿刺行胎儿性别鉴定及胎儿Rh溶血诊断 • 1966年 Mark steele和Roy Breg从羊水中分离出羊水细胞培养成功并行胎儿核型分析 南京鼓楼医院
羊膜腔穿刺—时间 • 16—20周 南京鼓楼医院
羊膜腔穿刺—抽取量 • 20—30ml 南京鼓楼医院
抽取的羊水用途 • 核型分析——诊断染色体病 • DNA分析——诊断单基因病 • 生化测定——诊断NTD、代谢性疾病 南京鼓楼医院
羊水穿刺 • 穿刺前孕妇俯卧位摇动腹部 • 超声波定位引 导 • 采用22号或21号带芯长腰穿刺针头 • 垂直、快速进针 • 抽取羊水2ml弃置,换空针抽取羊水 南京鼓楼医院
羊膜腔穿刺—并发症 • 胎儿丢失 • 羊膜腔感染 • 羊水渗漏 • 穿刺部位的出血、血肿 南京鼓楼医院
羊穿并发症---胎儿丢失 • 1976年,Nihd Registry 报道流产率3.5% • 1986年,Tabor et al 报道流产率1.7% • 1995年,Bombard et al 报道流产率1.3% • 2000年, Antsaklis 报道流产率2.1% 南京鼓楼医院
脐带血穿刺—历史 • 1972年,Valenti用儿科膀胱镜在中期妊娠孕妇行子宫切开术插入羊膜腔,获取脐血标本。 • 1979年,Rodeck和Campell应用胎儿镜行脐带血管穿刺,但由于并发症高,应用受到限制。 • 1983年,Ternand Daffos超声引导下经皮脐血管穿刺取血(Cordocentesis) 南京鼓楼医院
脐带血穿刺—时间 • 16周—分娩(最佳24—28周) 南京鼓楼医院
脐带血穿刺—取血量 • 3—5ml • 20周后抽取6—8ml对胎儿循环无不良影响 南京鼓楼医院
脐带血穿刺—适应症 • 胎儿核型分析或基因检测(胎儿畸形、严重的FGR、羊水或绒毛细胞培养失败、羊水或绒毛培养结果为嵌合体、非免疫性胎儿水肿、脆性X综合症等) • 胎儿血液疾病分析(血型、血小板计数等) • 胎儿感染(弓形虫、病毒感染等) • 胎儿情况评估(酸碱平衡、甲功等) • 遗传性疾病(单基因病、凝血障碍、血红蛋白病、代谢性疾病等) • 胎儿治疗(宫内输血、宫内药物治疗等) 南京鼓楼医院
脐带血穿刺—并发症 • 穿刺部位的出血 • 脐带血肿 • 短暂性胎心减慢 • 宫内感染 • 胎儿丢失(流产、早产) • 大多数并发症为短暂性和非致命性 南京鼓楼医院
脐带血穿刺并发症—胎儿丢失 • Maxwell 1991年报道胎儿超声结构筛查示正常超声者脐穿的流产率为1%(1/76);异常超声者流产率为7%(5/76);胎儿结构明显异常者流产率为25%(9/36) • Antsaklis 1998年报道胎儿超声结构筛查示正常超声者脐穿的流产率1%(2/191);异常超声者流产率为13%(11/84) 南京鼓楼医院
脐带穿刺部位 南京鼓楼医院
脐血穿刺—确定胎儿血样 • 血红蛋白电泳 • Kleihauer-Betke试验:胎儿红细胞在酸中稳定 • APT试验:NaOH中胎儿血为粉红色 • 有核红细胞的出现 南京鼓楼医院
脐血穿刺—排除脐血中母血污染 • X染色体DMD基因内部5对CA重复序列的连锁分析 南京鼓楼医院
绒毛组织的培养 • 直接法 • 培养法(悬浮培养、贴壁培养) 南京鼓楼医院
绒毛组织的染色体检查—直接法 • 孕早期Langhan’s细胞有较高的有丝分裂活性,能提供足以分析的良好有丝分裂相,较绒毛培养简易可靠、操作简单快速 南京鼓楼医院
绒毛组织的染色体检查—直接法 • 绒毛组织的分离洗脱 • 加秋水仙素(终浓度2ug/ml,可一次加,也可分次少量加) • 37OC 5%CO2培养箱培养45分钟 • 低渗(1%枸橼酸钠低渗10分钟或1%枸橼酸钠和0.075mol/l 1:1低渗40分钟) • 预固定(甲醇:冰醋酸 3:1)10分钟 • 固定(甲醇:冰醋酸 3:1)10-20分钟 • 冰醋酸解离绒毛细胞(轻吹打) • 制片 南京鼓楼医院
绒毛组织的染色体检查—悬浮培养法 • 绒毛挑选洗脱 • 绒毛组织剪成小块入培养瓶(25ml培养瓶每瓶10mg) • 加特定培养液3ml • 培养3-6天 • 收获(加秋素、低渗、固定、制片) 南京鼓楼医院
绒毛组织的染色体检查—贴壁培养法 • 绒毛组织挑选洗脱 • 绒毛组织剪成小块 • 加0.25%+0.02%EDTA 5ml 37OC 摇床中20分钟 • 加培养基终止消化,离心后弃上清加培养基接种培养5-10天 • 收获 南京鼓楼医院
羊水细胞培养—细胞类型 • 成纤维样细胞(F细胞) • 上皮样细胞(密集型上皮样细胞-E细胞、镰刀样上皮细胞、圆形上皮细胞) • 羊水样细胞(AF细胞) 南京鼓楼医院
羊水细胞培养—收获方法 • 原位法 • 消化法 • 刮取法 南京鼓楼医院
羊水细胞培养中存在的问题——污染 • 细菌 • 真菌 • 支原体 • 病毒 • 其他细胞 南京鼓楼医院
羊水细胞培养中存在的问题——母体细胞污染 • 若胎儿为男性,由于母体细胞污染误将胎儿诊断为嵌合体 • 母体细胞在培养中占优势 南京鼓楼医院
羊水细胞培养中存在的问题——母体细胞污染的预防羊水细胞培养中存在的问题——母体细胞污染的预防 • 羊水穿刺时,把最先抽得的1-2ml羊水弃掉 • 染色体多态现象的测试 • 羊水细胞、母体细胞 的HLA组织定型鉴别 南京鼓楼医院
羊水细胞培养中存在的问题——细胞不生长、不贴壁羊水细胞培养中存在的问题——细胞不生长、不贴壁 • 最常见的原因是支原体污染 • 培养基PH不适当,偏酸(<6.4或偏碱>7.4均不利 • 最合适的穿刺时间16-20周 南京鼓楼医院
羊水细胞培养中存在的问题——细胞及染色体收获少羊水细胞培养中存在的问题——细胞及染色体收获少 • 每天观察细胞生长(梭形细胞背景上有透明透亮的圆形细胞) • 滚圆的细胞与有丝分裂的圆形细胞鉴别 • 操作应轻柔,胰酶消化法要掌握好胰酶消化的时间 • 羊水中胎脂多时3-5天可轻轻动一动,减少胎脂贴壁占据空间 • 低渗时间短于外周血(一般3-5分钟) 南京鼓楼医院
脐带血细胞培养 • 量少于外周血(一般5ml注射器小于14滴) • 其他同外周血 南京鼓楼医院
Thanks! 南京鼓楼医院