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实验二 质粒 DNA 的酶切鉴定

实验二 质粒 DNA 的酶切鉴定. 【 目的要求 】 1 ．了解一般限制性内切酶的特性； 2 ．学习设计酶切方案的一般规律 , 载体与供体进行酶切 ； 3 ．掌握酶的保存与使用方法； 【 实验原理 】

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实验二 质粒 DNA 的酶切鉴定

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Presentation Transcript

  1. 实验二 质粒DNA的酶切鉴定 【目的要求】 1．了解一般限制性内切酶的特性； 2．学习设计酶切方案的一般规律,载体与供体进行酶切 ； 3．掌握酶的保存与使用方法； 【实验原理】 限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，共有I型、、II型、III型三类， II型限制性内切酶识别含4－8个核苷酸且具有回文对称性质的核酸序列，并在识别序列内或侧旁特异性位点切开DNA双链，产生平齐末端和带单链突出端（粘性末端）的DNA片断，常用于基因克隆的载体切割、外源DNA的制备。在分子克隆中I、III类型限制性内切酶都不常用。

  2. 组成成分 单酶切 双酶切 质粒 6~8 6~8 酶1 0.5 0.5 酶2 --- 0.5 10X缓冲液 2 2 去离子水 11.5 12 总体积 20 20 【实验器材】 台式离心机、振荡器，恒温水浴，微量移液器（20uL, 200 uL 1000uL）,1.5mL Enpendorf管 【实验材料】 限制性内切酶及酶切缓冲液、无菌水， 【实验内容】 1．酶切有关基础知识介绍： 2．小量酶切，电泳鉴定 3. 酶切体系的建立： 表3. .质粒酶切反应体系的建立

  3. 影响限制性内切酶的因素很多，酶反应条件是实验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系、DNA的纯度和浓度等。影响限制性内切酶的因素很多，酶反应条件是实验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系、DNA的纯度和浓度等。 • 酶切反应体系的组成：DNA量→酶量（最多占总体积的1/10）→总体积，即根据所用DNA的量确定用酶量，再根据用的酶量确定总体积。一般较好的酶切反应体系中DNA用量不高于1.5ug/50uL。酶切时加样顺序一般应为：水+缓冲液+DNA+酶，以保证酶的活性。向管中加入每个组分后都要用手指轻拨管子以利混匀，最后加酶混匀，5’离心后保温酶切。

  4. 限制性内切酶分类 • I型限制性内切核酸酶有其特定的DNA识别序列，但酶在DNA上的切割位置远离其识别位置，有的酶可在同识别序列相距1 000 bp的位置上随机切割。 l型限制酶对体外重组DNA实验没有多少用处。 • III型限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列，其酶切位置在识别序列3‘端之外相距约20个碱基对处，可以产生各种类型的单链末端。Ⅲ型酶有其特定的用途。 • II限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列即，回文结构，通常为4-8bp，在特定识别位点处切割DNA。是基因工程中主要使用的酶类。

  5. BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ Not I 5’-GCGGCCGC-3’ 3’-CGCCGGCG-5’ EcoRI 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 3.旋转对称性； 4.切点大多数在识别顺序之内，也有例外。 Fok I 5’-GGATGNN -3’ 3’-CCTAC NN-5’ 外侧，产生3’-端突起 限制性内切酶的识别序列 限制酶特点： 1.识别４-8个相连的核苷酸，以6个多见； 2.呈回文结构(palindrome)； 5. 识别序列严格，少数有变动，序列中的核苷酸被甲基化后，不能被切割。

  6. 限制性内切酶的切割方式 内切酶切割后产生的三种末端 a) 5’ 突出的粘性末端 如, EcoR I 5’-G  AATTC-3’ 3’-CTTAA  G-5’ b) 3’ 突出的粘性末端 如, Pst I 5’-CTGCA  G-3’ 3’-G  ACGTC-5’ c) 平末端 如, Sma I 5’-CCC  GGG-3’ 3’-GGG  CCC-5’

  7. 同列裂酶和同尾酶 （1）同裂酶（Isoschizomers) 同裂酶:能识别相同序列，切割位点可以相同也可以不同，来源不同的酶。 ① 完全同裂酶： 识别位点和切点完全相同。如Hind Ⅲ 和Hsu I。 Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’

  8. ② 不完全同裂酶： 识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。

  9. （2）同尾酶(Isocaudamers） 同尾酶 ( Isocaudamers ) :识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ BamH I Bgl Ⅱ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ Bcl I 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ 5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’ Xho Ⅱ U代表嘌呤；Y代表嘧啶。

  10. Sau3A 5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’ 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。 ？ GATCT-3’ A-5’ 5’-G 3’-CCTAG BglⅡ BamHI 5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’ BglⅡ BamHI Sau3A

  11. 部分同裂酶的切割位点

  12. 部分同尾酶切割位点

  13. 影响限制性内切酶活性的因素 1. DNA的纯度 DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。 一般采取 ①纯化DNA ②加大酶的用量 ③延长保温时间 ④ 扩大反应体积（ >20l）

  14. 2. DNA的甲基化程度 大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒： dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。 基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。

  15. 3. DNA的分子结构 DNA的分子结构有三种 超螺旋结构、线性结构、单链开环结构 对不完全消化具有一定的影响

  16. 4. 缓冲液(Buffer) 是影响限制酶活性的重要因素。 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。 缓冲液的化学组成 MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；

  17. 5. 酶切消化反应的时间和温度 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。

  18. 6. 反应体积和甘油浓度 质粒酶切鉴定通常设定反应体积为10-20μl, 质粒酶切大量酶切通常设定反应体积为80-100μl。 限制性内切酶储存在含50%的甘油缓冲液中，酶切时甘油的浓度不应超过1/10体积。否则对酶活性有抑制作用。

  19. 7.星号（*）活性 限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。 所以一般使用专一的反应缓冲液。 星号（*）活性 如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。

  20. 使用的时候要特别注意！ EcoR I和BamH I等都有*活性。 EcoR I： GAATTC 在低盐、高pH（>8）时可识别和切割 GAATTA、AAATTC、GAGTTC等

  21. 限制酶酶切反应的终止 大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。 或用乙醇沉淀DNA。

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