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结核病 实验室 基本要求和痰涂片检查 ___ 选自 结核病诊断 实验室检验规程 河南 CDC 结核病预防控制所 闫国蕊. 结核病实验室检验基本规则. 分枝杆菌菌群中有相当部分是具有较强传染性的菌株，在进行分枝杆菌实验室研究与检验时，应根据不同的实验内容，在实验室基本工作条件、仪器设备、安全防护、废弃物的处理等各方面严格遵循相应的规则，确保实验人员和环境的安全。. 第一节 实验室基本要求. 一、涂片实验室基本要求 1. 实验室的分区与布局应符合生物安全防护的基本要求。 2. 实验室出口处应设专用洗手池。
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结核病实验室检验基本规则 • 分枝杆菌菌群中有相当部分是具有较强传染性的菌株，在进行分枝杆菌实验室研究与检验时，应根据不同的实验内容，在实验室基本工作条件、仪器设备、安全防护、废弃物的处理等各方面严格遵循相应的规则，确保实验人员和环境的安全。
第一节 实验室基本要求 一、涂片实验室基本要求 1.实验室的分区与布局应符合生物安全防护的基本要求。 2.实验室出口处应设专用洗手池。 3.实验室的墙壁、天花板和地面应平整、易清洁、不渗水、耐化学品和消毒剂的腐蚀,地面应防滑。 4.实验台面应防水，耐腐蚀、耐热。
一、涂片实验室基本要求 5.实验室中的储物柜和实验台应牢固,彼此之间应保持一定距离，便于清洁。 6.实验室如有可开启的窗户，应设置纱窗。 7.实验室内应保证工作照明，避免不必要的反光和强光。 8.实验室应有适当的消毒设备。 9.实验室入口处应设挂衣装置，个人便装与实验室工作服分开放置。
痰涂片镜检室布局范例 可以开关的窗户 记录用 的桌子 染色池 显微镜 采 光 用 窗 户 （固定） 工作台 (通风柜) 试 剂 柜 收集标本 用的桌子 实验室门
二、培养和药敏实验室基本要求 1.满足涂片实验室的基本要求，并符合生物安全防护的要求。 2.实验室门应带锁可自动关闭，并有可视窗。 3.实验室应设实验操作间和准备间，具有足够的空间进行实验和放置物品。 4.进入实验室应使用专用工作服，操作时应戴口罩、帽子和乳胶手套 。
二、培养和药敏实验室基本要求 5.实验室的工作区域外应有存放个人衣物的条件。 6.实验室所在的建筑内应配备高压蒸汽灭菌器，并按期检查和验证，以保证符合要求。 7.实验室内应配备Ⅱ级生物安全柜。 8.实验室宜设应急洗眼和喷淋冲洗设施。
二、培养和药敏实验室基本要求 9.实验室如使用窗户自然通风，应有防虫纱窗。 10. 实验室必需有可靠的电力供应和应急照明。重要设备如生物安全柜、培养箱、冰箱等专用设备电源。 11.实验室出入口应有在黑暗中可明确辨认的标识。
第二节 实验室安全防护和污物处理 一、目的 各级结核病细菌学实验室必须对工作人员给予充分保护，同时控制对环境造成的污染。在实验室从事试验或工作的人员，应当了解可能接触到的各类危险物的种类和性质，明确这些危险物对自身、他人及环境具有的潜在威胁。严格按照实验室操作规程做好安全防护和污物处理。
二、结核病细菌学实验室中存在的危险物 结核病细菌学实验室的工作人员，在分枝杆菌检验过程中可能接触到各类危险物，特别是许多操作易产生分枝杆菌气溶胶。操作人员必须认真了解各类危险物的性质，便于注意个人安全防护。
三、实验室安全防护基本原则 1.进入实验室，尽量避免携带非必需物 品。必要的文具、书籍带入后必须远 离毒菌操作区。 2.实验室工作人员应注意着装整齐，操 作时穿戴好实验服、口罩、帽子和相 应隔离服装、手套，蓄发者须将头发 装束在帽子内。
三、实验室安全防护基本原则 3.实验室内应保持肃静，试验过程中禁止一 切与试验无关的活动，以利于集中精力完成实验操作。 4.实验台上不可放置任何与实验无关的物件 或私人用品。 5.实验过程中绝对禁止吸烟、饮食及用嘴湿 润铅笔或标签等，也不要以手抚摩头面部等。
三、实验室安全防护基本原则 6.试验前须开启紫外灯对实验室和操作区域 进行照射消毒1h以上；试验结束后，立即 开启紫外灯对操作区和实验室进行照射消 毒2h以上。 7.任何试验的开始和结束后，操作人员要仔 细地用肥皂和清水将双手洗净。 8.每次试验操作终止后，必须清理好实验台 所有物品归位并用75%乙醇溶液或3-5% 石 炭酸擦洗实验台和地面。
三、实验室安全防护基本原则 9.实验室中的生物危险物要根据检查项目和性质不同，局限在相应的实验室或试验区，不得随意将其带到其它实验室或区域进行试验。 10.实验室内任何微生物的样品、废弃物都必须经高温高压灭菌后，方可按一般垃圾处理。
四、实验室安全操作原则 1.首先各级实验室应按等级要求完善实验设施，如生物安全操作柜的抽气排风功能、紫外灯消毒，生物安全操作柜内的除菌滤膜定期更换等。 2.普通实验室应注意气流方向，实验过程中尽量避免强气流变化而产生气溶胶（如：涂片、染色过程中）。 3.实验室的菌种开封、细菌分离培养或其它操作，应在Ⅱ级实验室或Ⅲ级实验室的生物安全操作柜中进行。
四、实验室安全操作原则 4.使用接种环进行操作时，接种环应在工作 灯的内焰中燃烧，以避免菌液或菌块飞溅。 5.稀释菌液时，吸管、针管要缓慢插入试管 或烧瓶底部，小心操作避免产生气泡或气 溶胶。 6.实验中使用注射器时，用过的针头切勿再 重新入套或拔开注射器与针头，应直接放 入锐器收集器，以免划破皮肤造成接种感 染。
四、实验室安全操作原则 7.实验结束后，操作过程中所有可能与生物 危险物接触或被污染的实验器械和物品， 能够高压消毒的必须进行高压消毒；不能 进行高压消毒的设备仪器，应使用有效的 消毒剂擦洗后再以紫外近距离长时间消毒。 8.实验中发生意外污染情况，应立即通知主 管人员并做好处理污染物和相应区域的准 备，在未通知主管人员之前，不利擅自进 行消毒处理。
五、污物处理及消毒 1.各级实验室含有生物危险物的临床标本及 被污染的一次性用品，实验完成后，应在 操作台或实验区域内以紫外灯近距离照射 消毒2h以上后，再经高压消毒后方可丢弃 或焚烧。 2.可重复使用的实验用品及器械，完成检查 或实验测试后，亦应在操作台或实验区域 内经紫外灯近距离照射消毒2h以后,再交 有关人员进行高压消毒和洗刷。
五、污物处理及消毒 3.实验用的试管、吸管、注射器，须装在加 盖不漏的容器内，经高压消毒后拿出实验 室。 4.培养物或实验室垃圾，在丢弃前必须经过 高压消毒和紫外灯近距离长时间照射处理。 5.实验室内未经消毒的污水，禁止直接排入 公共排水系统，更不允许混入居民生活垃 圾。
六、意外事故的处理 1.实验过程中，如标本或含标本的前消化 处理液被打翻污染操作台或地面，应以 吸满75%乙醇溶液的卫生纸覆盖污染区， 15 分钟以后卫生纸方可移去。
六、意外事故的处理 2.实验过程中，如污染物溅落到身体表面，或有割伤、刺伤、烧伤、烫伤等情况发生,应立即停止实验工作进行紧急处理；更换被污染的实验服装，皮肤表面用消毒液清洗，伤口以碘酒及酒精消毒，眼睛用无菌生理盐水冲洗。
六、意外事故的处理 3.如果发生菌液溢出、带菌的培养管破碎等, 造成中、小面积污染。可用比污染面积大 25%以上的纱布覆盖污染区域，边缘用脱 脂棉围住，向纱布倾倒5%苯酚或75%乙醇 溶液，浸泡2h以上（其间适量添加溶液 防止干燥），再经紫外灯近距离（1m内） 照射2h以上；被污染的器械、容器等立即 浸泡于75%乙醇溶液中2h以上，实验完成 后再进行高压消毒处理。
六、意外事故的处理 4.如果发生气溶胶污染或大面积污染,应立即停止实验并关闭实验室，对实验区域和实验室进行紫外灯照射消毒过夜；第二天对污染区域进行24h封闭熏蒸消毒（乙醛消毒法：5ml乙醛+2g高锰酸钾/m2），直接被污染的区域可参照第3条进行处理。
七、绝对禁止使用的事故处理方法 1.有可能造成污染面积扩大，如使用75%乙 醇或甲酚皂液擦洗被污染的区域。 2.直接用火焰对未经任何处理的污染地面、 操作台、器械进行烧灼处理。 3.使用消毒效果未经证实的消毒剂进行消毒。 4.使用低浓度的消毒剂和紫外灯进行短时间 长距离照射消毒。
第二章 分支杆菌涂片检查 在结核病控制工作中痰结核菌检查对于发现传染源、确定诊断和化疗方案、考核疗效、评价防治效果具有重要意义。结核病细菌学检查是国家结核病控制规划(NTP) 的重要组成部分，在现代结核病控制工作中起着不可缺少的重要作用。
第一节 痰标本采集 在结核病的实验室诊断工作中，最常用的标本是痰标本，标本的质量直接影响检出结果，故标本的采集应在医生的指导下进行。如不能及时完成检查，为避免污染菌大量繁殖。应4℃冰箱保存。需进行分离培养的标本应在标本采集后的72h内完成前处理和接种程序。
一、标本的容器 采用世界卫生组织（WHO）推荐的国际通用螺旋盖痰瓶，或可密封塑料盒、蜡纸盒收集痰标本（参考规格：直径 4㎝，高度2㎝）。痰容器应标明病人姓名、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）、检查项目和容器序号1、2、3。
二、 痰标本采集 根据痰标本采集的时间，可将标本分为三类： • 即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液； • 晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出 的第2口、第3口痰液； • 夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出的痰 液； 无痰患者可采用雾化引痰或鼻咽拭子采集标本。其他标本采集略……
三、 痰标本的性状 • 合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物。 干酪痰：标本外观以黄色(或奶酪色)、脓样、团块状的肺部分泌物为主，粘度较粘液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可发现大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。由于此类标本是由肺部深处咳出，对肺结核的诊断最有价值，故AFB的检出率较高。
三、 痰标本的性状 血痰：此类标本是在粘液痰或干酪痰标本中混有血液，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察到粘液痰或干酪痰的细胞特征外，含新鲜血液的标本中可见到被染色的血细胞。由于含血标本易干扰AFB镜检的结果，故在制片时应尽量避免挑取含血部分。
三、 标本的性状 粘液痰：标本外观以白色、粘稠度较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞，伴有少量肺上皮脱落细胞、脓性炎症细胞、口腔脱落细胞及口腔寄生菌，此类标本的AFB检出率较唾液高。
三、 痰标本的性状 唾液：目视观察标本整体外观，以透明或半透明水样、粘度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱落细胞(形态不规则、细胞核着色较细胞质深，核质比接近或大于 1:2)和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。由于此类标本进行AFB检查时的检出率很低，用于对患者确定诊断时是不合格的标本。
三、 痰标本的性状 • 患者留取的痰标本，应由检验人员或经培训的专人目视检查标本质量(特别是用于初次诊断的痰标本)：标本量一般在3-5 ml，标本性状属于干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、粘液痰者为合格的标本；痰标本不合格者，应在进一步指导后重新送检。进行细菌学检查时应在登记本和检验报告单上注明标本性状，以供分析结果时参考。
第二节 涂片镜检方法 一、玻片的制备 应使用以95%乙醇擦拭(或浸泡)脱脂，经干燥、清洁、无油污、无划痕的新载玻片制备涂片，在玻片正面一端的1/3处注明实验室序号及标本序号。如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可使用2B铅笔在磨砂面上直接书写。
一、玻片的制备 ⑴ 直接涂片 • 用接种环或折断的竹签茬端挑取痰标本的脓样、干酪样部分约0.05－0.1 ml，于玻片正面的右侧2/3中央处均匀涂抹成10×20 mm左右的椭圆形痰膜。痰膜朝上静置自然干燥 (一般约需要30min)后准备进行抗酸染色。 • 为了保证检验人员的安全，痰标本直接涂抹时，严禁同时对载玻片进行加热。
一、玻片的制备 ⑵漂浮集菌涂片 • 痰标本经高温（85℃水浴30min）或高压蒸气20min液化和灭活处理，取出放冷后，取5－10ml盛于容积为100ml的玻璃容器内（口径约2 cm），加灭菌蒸馏水20－30ml，总体积勿超过容器的1/3，加二甲苯0.3ml，盖紧瓶盖，放振荡器上振荡10min，加蒸馏水置满瓶口，把已编号的载玻片盖于瓶口上，使液体油膜层与玻璃片紧密接触，放置30min，取下载玻片，自然干燥，火焰固定，染色镜检。
一、玻片的制备 ⑶离心沉淀集菌涂片 • 痰标本经液化和灭活后，取5-10ml左右在3000 g离心15-30min，使结核菌集中于试管底部，取沉淀物涂片，自然干燥，火焰固定，染色镜检。
二、染色方法 （1）涂片自然干燥后，放置在染色架上，相邻玻片的距离应保持在10 mm以上；火焰固定(在5秒钟内将玻片置于火焰上来回烘烤4次)。 （2）滴加石碳酸复红染液，盖满痰膜，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5min。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染液。加温时勿使染液沸腾。
二、染色方法 （3）流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。 （4）自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色3min；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。
二、染色方法 （5）流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。 （6）滴加亚甲蓝复染液，染色30s。 （7）流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去玻片上剩余的水。待玻片干燥后镜检。
涂片抗酸染色检查方法 Z－N染色步骤 操作流程 5% 盐 酸 酒 精 脱 色 1-3 分 钟 复 红 加 热 初 染 5 分 钟 涂 痰 膜 自 然 干 燥 自 然 干 燥 镜 检 美 兰 复 染 30 秒 流 水 冲 洗 流 水 冲 洗 流 水 冲 洗
