Pro on-line UV-Vis detekci je délka optické dráhy rovná průměru kapiláry tedy pouze desítky m m

1. On-line prekoncentrační techniky v CE • Běžně se v kapilární CE technikách dávkuje řádově v nanolitrech = CE by mohla být poměrně velmi citlivou metodou. • ALE: Např. pro on-line UV detekci platí Lambert-Beerův zákon • A = .l.c • …. Molární dekadický absorpční koeficient l…. Délka optické dráhy c…látková koncentrace Pro on-line UV-Vis detekci je délka optické dráhy rovná průměru kapiláry tedy pouze desítky mm „Sample overloading“ = v praxi se nastřikuje zóna vzorku ne delší než 1-2% celkové délky kapiláry

2. Obecnou nevýhodou CE spojenou s UV detekcí je nízká koncentrační citlivost. Problémem je krátká absorpční dráha UV paprsku – univerzálního zlepšení citlivosti může být dosažením použitím tzv. „bubble“ detekční cely

3. Dalším univerzálním řešením je využití tzv. Z-cely V obou uvedených případech dochází ke zvýšení citlivosti zvýšením poměru S/N.

4. Úprava detekční cely je technicky a finanční náročná On-line prekoncentrace – zakoncentrovaní požadovaných analytů přímo v kapiláře po nadávkování. Výhody: 1. není nutná úprava experimentálního zařízení 2. on-line prekoncentrace jsou rychlé na rozdíl od off-line postupů 3. nedochází ke ztrátám analytu vlivem složitého extrakčního postupu. Nevýhody: 1. je nutné optimalizovat celý prekoncentrační postup i s přihlédnutím k matrici vzorku 2. neexistuje univerzální postup 3. není možné zakoncetrovat jakýkoli analyt 4. současně se zakoncentrují i balastní látky

5. On-line prekoncentrace využívá nadávkování větší zóny vzorky (více než odpovídá ~ 1% celkového objemu kapiláry) a následné zakoncentrování původně široké zóny vzorky na velmi úzkou zónu. Látkové množství analytu zůstává stejné mění se objem zóny. Hydrodynamické dávkování Hydrodynamické dávkování je limitováno objeme kapiláry!

6. On-line prekoncentrační techniky s využitím hydrodynamického dávkování vzorku - + + + + + + + IR1 IR2 U = IR1 + IR2 U = I.R Intenzita elektrického pole v jednotlivých zónách je dána vodivostí (odporem) dané zóny. Konduktivita G = 1/R

7. Nadávkováním vzorku s nižší vodivostí dochází po vložení elektrického pole ke generaci vyšší intenzity elektrického pole v zóně dávkovaného vzorku. Složky vzorku migrují rychleji na základě vztahu: V okamžiku kdy urychlené ionty narazí na rozhraní zóny vzorku a pracovního elektrolytu dojde ke zpomalení iontů, které ale tvoří úzkou zakoncentrovanou zónu a nastává separace. Poměr rychlostí migrace v zóně vzorku a separačního pufru určuje prekoncentrační faktor . Prekoncentrační faktor pak určuje koncentraci analytu v zakoncentrované zóně.

9. On-line prekoncentrace s využitím přechodné změny pH (dynamic pH junction) Většina separovaných analytů pomocí CE jsou slabé elektrolyty. Rychlost jejich migrace je ovlivnitelná změnou hodnoty pH protředí ve kterém migrace probíhá. Příklad: prekoncentrace slabé kyseliny Analyt chovající se jako slabá kyselina je rozpuštěn v kyselém prostředí = potlačená disociace analytu a elektroforetická mobilita je blízká 0. + OH- - - - pH ~ 2 pH ~ 7 Po vložení napětí je zóna vzorku titrována OH- ionty a analyt je postupně ionizován. Negativně nabitý analyt má tendenci migrovat ke kladně nabité elektrodě, vstupuje do kyselé zóny a jeho mobilita opět poklesne. Na rozhraní obou pH vzniká neutralizační zóna.

10. Pro on-line prekoncentraci s využitím přechodné změny pH je nutné aby iontová síla elektrolytu s vyšším pH byla poměrně vysoká (vysoká koncentrace pufru) , ale mobilita pufrujícího iontu by měla být malá. Naopak kyselá zóna obsahující analyt by měla mít vysokou iontovou sílu a mobilita pufrujícího iontu by měla být vysoká.

12. 1 – phenol 2 - katechol Přechodná změna pH umožňuje prekoncentraci analytů vždy v úzké oblasti pK. Proto je potřebné pro prekoncentraci analytů s různými pK najednou využít jiné prekoncentrace

13. On-line prekocentrace s využitím přechodné izotachoforézy (tITP – CZE)

14. Elektromigrační děje v ITP jsou řízeny Kohlrauschovou regulační funkcí (platí pouze pro uni-univalentní elektrolyty v tzv. „safe pH“ regionu pH 3 – 10. V kapiláře je nutno zajistit takové podmínky aby na určitou dobu probíhala izotachoforetická migrace iontů vzorku spolu s jejich koncentračním přizpůsobením dle KRF. Vzorek musí obsahovat ionty které budou tvořit vedoucí a koncový elektrolyt. CZE 10 x ředěné sliny

15. tITP s využitím složení vzorku

16. Spojení CE-MS • Spojení vysoce účinné separační metody s identifikační metodou • MS umožňuje i další separaci nedokonale rozseparovaných analytů v CE kroku. • Kritické spojení obou technik • Přechod mezi dvěma tlaky – v separační kapiláře normální tlak • - v MS snižený tlak až vákuum (nutnost účinné evakuace MS) Možná realizace spojení CE s MS Sheath-liquid interface

17. Řešení bez přídavného toku kapaliny Nejčastěji je CE spojována s MS s pomocí ESI jako ionizační techniky (okrajově i s APCI). Proč přídavný tok? Průtok elektrolytu v kapiláře je řádově v destinách µl/min. Pro dosažení dostačné stability elektrospreje je nutný průtok řádově v jednotkách µl/min. Přídavný průtok tedy umožňuje stabilní sprejování a ionizaci analytů. V případě spojení bez přídavné kapaliny je potřeba použít menší průměr kapilár 25 µm

18. Praktické omezení spojení CE-MS • nutno používat těkavé pufry na bázi těkavých organických kyselin a zásad (kyselina octová, mravenčí, amoniak, triethylamin) • přídavná kapalina je tvořena směsí methanolu a vody a přídavkem kyseliny nebo zásady případně separačního pufru. • není možné používat netěkavé aditiva jako jsou tenzidy, chirální selektory, polymery apod. – pouze s využitím techniky částečného plnění. Pro ionizaci v kladném módu musí být v přídavné kapalině těkavá kyselina (octová, mravenčí) Pro ionizaci v záporném módu musí být v přídavné kapalině těkavá báze (amoniak).

19. Aplikace CE-MS