亲和层析法

亲和层析法 • 1原理：要有一对具有高亲和性的分子 • 2亲和吸附剂：有很多亲和性吸附剂可利用 • 3金属螯合层析法：利用分子与金属的吸引力

亲和色谱原理：酶与载体之间的特异性作用。亲和洗提酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂上，然后用适当的底物特异地洗提。亲和色谱原理：酶与载体之间的特异性作用。亲和洗提酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂上，然后用适当的底物特异地洗提。

■ 亲和层析法的四项要素： 配体 Ligand (A) (1) Solid Matrix 耦合反应(3) Coupling Reaction 洗脱 Elution (4) B (2) B B Specific Binding Substance (B) 杂质 B B

■ 亲和层析法的作用机理： (1) (2) (3) X B Washing Elution A A A Sample B 亲和基团配体 X B 固相载体

■ 典型的亲和层析操作： Protein Activity pH 2.05 * Elution volume

■ 专一性作用力的种类： II. Interaction Forces: (1) Hydrogen bond (2) Hydrophobic interaction (3) Electrostatic interaction (4) Van der waals interaction I. Conformational Match: Van der waals interaction 两分子间因构象互补所造成的吸引力是由范德华力所贡献 + - =O…H-N- Kd +

Van der Waal interactions ■ 构型互补所产生的吸引力：范德华键数目够多就足以产生亲和力 vdw vdw between non-polar surfaces

■ 生化分子的反应基团： 氰基 -C N ●●●●● 醛基 -HC=O ●●● 羧基 -COOH 胺基 -NH2 ●● 醇基 -OH 硫醇基 -SH ● 醚 -O- ● 烷基 -CH3 X

■ 可与各种配体基团反应的载体： Pharmacia 配体基团親和性载体反应基团反应方式直接反应 CNBr-activated Sepharose 4B -C≡N 加 EDC* -COOH -NH2 CH-Sepharose 4B 或活化型直接反应 N-OH-succinimide Oxirane环氧己烷 Epoxy-activated Sepharose 4B 直接反应加 EDC* -NH2 -COOH AH Sepharose 4B 直接反应 -OH oxirane Epoxy-activated Sepharose 4B 直接反应 oxirane Epoxy-activated Sepharose 4B -SH DTT 活化 -S-S-R Thiopropyl-Sepharose 4B 直接反应 -G-S-S-R Activated thio-Sepharose 4B * EDC = N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl

■ 亲和性载体的反应基团： CNBr -OH NH2-Protein NH -O-C N -O-C N -O-C-NH-Protein CNBr activated -NH-C-C-C-C-C-C-NH2 Amino Carboxylic -NH-C-C-C-C-C-C-COOH O O -NH-C-C-C-C-C-C-C-O-N N-Succinimide 琥珀酰亚胺 O -O-C-C-C-O-C-C-C-C-O-C-C-C Epoxy O OH spacer arm

■ 各种亲和性载体及其专一性基团： Pharmacia 配体親和性分子说明免疫吸附剂，大多自行合成对应的抗原抗体对应的酶酶的专一性结合底物或抑制剂部分 IgG 单株抗体纯化 Protein A 糖蛋白对a-D-葡萄糖、甘露糖基有专一性 Con A刀豆素凝血蛋白等 Heparin Sepharose CL-6B Heparin mRNA Oligo (dT)-cellulose Oligo (dT) NAD(P)+ 结合酶 Blue Sepharose CL-6B Cibacron-Blue NAD(P)+ 结合酶 5'AMP-, 2', 5'ADP-Sepharose 4B AMP, ADP 用来纯化lectin Lectin 单糖及衍生物 (还有更多其它亲和配体和载体)

■ 金属螯合层析法： imidazole 固相载体 Ni His His His Protein C-COOH elution -O-C-C-C-O-C-C-C-N C-COOH OH OH Metal Chelate Affinity Chromatography Juang RH (2004) ECX

Chitin Trypsin CH2OH CH2OH O O O O OH OH NH O=CH3 NH2 ■ 亲和层析法实例的原始材料： CHOM 鸡蛋粘多糖蛋白

■ 以亲和层析法纯化 Trypsin： Disc-PAGE SDS-PAGE Chitin CHOM Trypsin A B C&D 以凝胶电泳检验亲和层析操作过程各步骤样品→ A B C = D

■ Hydroxyapatite 吸附剂： 羟基磷灰石 (Ca5(PO4)3OH)2 可选择NaCl或磷酸等不同洗脱条件 Bio-Rad CHT

疏水性层析法：利用分子间的疏水性引力 • 液相分配：分子在两液相间的分配比例不同

■蛋白质表面的极性或非极性分布： Hydrophobic area Activie site Superxoide dismutase (SOD) Stryer L (1995) Biochemistry 4/e Fig. 21-36

■ 疏水性及反相层析法原理： C18 = -C18H37 HIC (liquid-solid) Reverse Phase Chromatography (liquid-liquid) Polar solvent Non-polar solvent Polar solvent + + + + Non-polar area + + Polar phase + + + + + Non-polar area Hydrophobic group Polar area Using non-polar groups as a stationary phase Using ion-exchanger C6 = -C6H13 Phenyl = -C6H6 Juang RH (2004) ECX

■ Hydrophobic interaction 色析法： Ammonium sulfate (% sat.) 25 0 BA 20 10 15 20 Ethylene glycol (%) Protein concentration 10 30 5 40 50 100 200 300 400 Elution volume (mL) Pharmacia HIC

选择色谱类型是最重要的也是设计知识面最广的难题。填料填料颗粒、孔径及柱尺寸大小流动相组合最佳分离纯化工艺蛋白质工业化分离纯化流程图合成（发酵，组织培养，多肽合成）提取和浓缩（匀化，离心，过滤，液-液萃取）预分离（吸附，沉淀，液—液萃取）精细分离和纯化（色谱）浓缩（超滤，排阻色谱）无菌过滤和干燥或结晶）选择色谱类型是最重要的也是设计知识面最广的难题。填料填料颗粒、孔径及柱尺寸大小流动相组合最佳分离纯化工艺蛋白质工业化分离纯化流程图合成（发酵，组织培养，多肽合成）提取和浓缩（匀化，离心，过滤，液-液萃取）预分离（吸附，沉淀，液—液萃取）精细分离和纯化（色谱）浓缩（超滤，排阻色谱）无菌过滤和干燥或结晶）

粒子范围和分离方法的选择

亲和层析法