干扰素的质量分析

干扰素的质量分析 项目三

基本信息 干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。

基本信息 1957年，英国病毒生物学家和瑞士研究人员，在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时了解到，病毒感染的细胞能产生一种因子，后者作用于其他细胞，干扰病毒的复制，故将其命名为干扰素。 1966-1971年，Friedman发现了干扰素的抗病毒机制。 1980-1982年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素。

基本信息 根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为：IFN-α、IFN-β、IFN-γ。干扰素(尤其是α-干扰素及γ-干扰素)除具有抗病毒、免疫调节的作用外，还具有明显的抗细胞增殖作用。因此，目前干扰素已被用于治疗多种白血病。

工作任务分解 干扰素α1b 原液的检定干扰素α1b 成品的检定

干扰素α1b（原液）的质量标准

干扰素α1b （成品）的质量标准

（一）干扰素的鉴别试验 （1）显色反应茚三酮反应、福林酚反应、双缩脲反应均可用来鉴别干扰素。

（一）干扰素的鉴别试验 （2）紫外吸收由于组成蛋白质的氨基酸中，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸在紫外区有光吸收，可用来鉴别干扰素。

干扰素（蛋白质）的颜色反应 • 1.茚三酮反应：酸性条件下，与茚三酮共热产生蓝紫色。 -CO2，-RCHO + -3H2O 互变异构紫色

干扰素（蛋白质）的颜色反应 • 2.双缩脲反应：碱性溶液中与Cu2+产生紫红色。可用于蛋白质的定性和定量分析，及检查蛋白质的水解程度。

干扰素（蛋白质）的颜色反应 • 3.酚试剂反应：蛋白质中酪氨酸、色氨酸与酚试剂反应显蓝色。福林-酚试剂法（Lowry法）: • 碱性+Cu2++磷钼酸-磷钨酸→蓝色 • 范围:25-250μg(Tyr,Trp的反应)

4.与2,4-二硝基氟苯反应（DNFB） 氨基酸能与2,4-二硝基氟苯发生反应生成N-2,4-二硝基苯基氨基酸。由于产物显黄色，所以此反应可以用于氨基酸的比色测定。此外， 2,4-二硝基氟苯是标记多肽N-端氨基酸的试剂。

知识拓展——免疫印迹法 （基因重组多肽类药物的鉴别）基本原理是借助聚丙烯酰胺凝胶技术，将生物活性物质高效分离，再与固相免疫学方法相结合。

知识拓展——免疫印迹法 （基因重组多肽类药物的鉴别）基本操作包括三个部分：聚丙烯酰胺电泳法；转移电泳即将凝胶中的多肽条带转移到硝酸纤维素纸上；检测或鉴定薄膜上的多肽条带。

（二）干扰素的杂质检查 （1）一般检查如酸度、水份、无机盐、溶液颜色和澄清度、无菌、热原、致敏、异常毒性等。

（二）干扰素的杂质检查 （2）特殊杂质检查蛋白质类药物中所含一些相关蛋白质杂质一般采用SDS-聚丙烯酰胺电泳法、液相色谱法、毛细管电泳法、HPLC法等方法。

（二）干扰素的杂质检查 对于基因工程类药物（如重组人β-IFN）的检查方法主要测定以下主要内容：分子量、肽图、等电点、紫外吸收、纯度、 N-末端氨基酸序列、外源DNA、残余 IgG等。

（二）干扰素的杂质检查 • 相对分子量：SDS-PAGE法电泳完毕后，以标准蛋白质分子质量的对数和其相对迁移率作图，得到标准曲线，根据所测样品的相对迁移率，从标准曲线上便可查出其分子质量。

（二）干扰素的杂质检查 • 相对分子量：SDS-PAGE法注意事项： 1)如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4g/1g 蛋白质的比率； 2)不同凝胶浓度适用于不同的分子量范围；

（二）干扰素的杂质检查 • 相对分子量：SDS-PAGE法注意事项： 3)测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量； 4)不是所以的蛋白质都能用此法测定分子量。

SDS-PAGE的原理： SDS是一种去污剂，可使蛋白质变性并解离成亚基。当蛋白质样品中加入SDS后， SDS与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带上大量的强负电荷，并且使蛋白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的带电荷量和分子形状的差异。

SDS-PAGE法： 因电泳的速度只取决于蛋白质分子量的大小，且蛋白质分子在电泳中的相对迁移率和分子质量的对数成直线关系。 lgMr = K – bm

SDS-PAGE

（二）干扰素的杂质检查 • 相对分子量：测定方法：SDS-PAGE法

（二）干扰素的杂质检查 • 相对分子量：其他方法： 1)沉降法（超速离心法） 2)凝胶过滤法 3)毛细管电泳法

（二）干扰素的杂质检查 2. 肽图检查：胰蛋白酶解+RP-HPLC 肽图分析可作为与天然产品或参考品的蛋白质一级结构做精密比较的手段。与氨基酸组成和序列分析合并研究，可作为蛋白质一级结构的精确鉴别。

（二）干扰素的杂质检查 3. 等电点测定：等点聚焦电泳在两性电解质存在下,电泳胶形成一个pH 梯度,蛋白质根据其等电点不同进行分离, 泳移至等电点pH位置上时净电荷为零而停止泳动,形成区带,用银染或考马斯亮蓝进行染色。

3.等电点的测定(等电聚焦电泳)

（二）干扰素的杂质检查 4. 紫外吸收：紫外光普扫描对于某种蛋白质或多肽来说，它的最大吸收波长是固定的。紫外吸收光谱是检查蛋白质的一个重要的指标。

（二）干扰素的杂质检查 5. 纯度：SDS-PAGE和HPLC 蛋白质的纯度一般是指是否含有其它杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小分子在内。

（二）干扰素的杂质检查 5. 纯度：SDS-PAGE和HPLC 按世界卫生组织规定必须用HPLC和非还原SDS-PAGE两种方法测定，其纯度都应达到95％以上才能合格。

（二）干扰素的杂质检查 6. N端氨基酸序列分析：Edman法 N端氨基酸序列作为重组蛋白质和肽的重要鉴别指标，一般至少测定15个氨基酸，可以很大程度上排除蛋白质混淆的可能，因为两种不同蛋白质N端15个氨基酸序列完全一致的可能性是很小的。

（三）干扰素的效价测定 方法：根据干扰素可保护人羊膜细胞（WISH）免受水泡性口炎病毒（VSV）破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，于波长570nm处测定其吸光度，可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素的效价。

（三）干扰素的效价测定 1. 溶液配制 1）RPMI1640培养液 2）完全培养液：量取新生牛血清10ml，加RPMI1640培养液90ml，4℃保存。 3）测定培养液：量取新生牛血清7ml，加RPMI1640培养液93ml，4℃保存。

（三）干扰素的效价测定 1.溶液配制 4）攻毒培养液：量取新生牛血清3ml，加RPMI1640培养液97ml，4℃保存。 5）标准品溶液：人干扰素国家标准品用测定培养液稀释至1000IU/ml。在96孔培养板中作4倍稀释，共8个稀释度。 6）供试品溶液：同标准品溶液处理

（三）干扰素的效价测定 2. 测定法：完全培养液培养WISH细胞，洗涤、消化后配制成2.5×105～3.5×105的细胞悬液，按每孔100μL接种于96孔板，37℃，5%CO2 条件下培养4～6h，将用攻毒培养液稀释的 VSV（100CCID50）按每孔100μL接种， 37℃，5%CO2条件下培养24h。

（三）干扰素的效价测定 2. 测定法：每孔加入染色液50μL，室温放置30分钟后洗去染色液，吸干水分，每孔加入脱色液 100μL，室温放置3～5分钟，混匀后，以 630nm为参比波长，于570nm处用酶标仪测定吸光度。

（三）干扰素的效价测定 3. 结果计算：试验数据采用四参数方程为基础编制的计算机程序自动计算出结果，也可以用稀释度的对数和相应的吸光度作直线回归，或者用半对数坐标作图法进行处理。

（三）干扰素的效价测定 3. 结果计算：求出标准品半效量的稀释倍数和供试品相当于标准品半效量的稀释倍数，按下式计算：待测样品效价=标准品效价×待测样品预稀释倍数×待测样品半效稀释倍数/（标准品预稀释倍数×标准品半效稀释倍数）

知识拓展——蛋白质类药物的效价测定 （1）蛋白质类激素的效价测定法（2）免疫血清及毒素的效价测定法（3）人免疫球蛋白及凝血因子的效价测定法（4）细胞因子的效价测定法（5）其他：蛋白质类酶的效价测定法；蛋白质类抗生素的效价测定法等

知识拓展——蛋白质类药物的含量测定 （1）凯氏定氮法

知识拓展——蛋白质类药物的含量测定 （2）双缩脲法（3）福林-酚法（Lowry法）（4）考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford法）（5）紫外吸收法（6）其他：酶联免疫法（ELISA）、HPLC 法、点膜结合法等

知识拓展——氨基酸序列分析 • 蛋白质多肽链的氨基酸顺序分析，即蛋白质一级结构的测定，主要包括以下几个步骤： 1. 分离纯化蛋白质，得到一定量的蛋白质纯品（>97%）。 2. 取一定量的样品进行完全水解，再用氨基酸自动分析仪，测定蛋白质的氨基酸组成。

3. 分析蛋白质的N-端和C-端氨基酸。 • 通常采用2,4-二硝基氟苯（DNFB）法和肼解法分别确定蛋白质的N-端和C-端氨基酸残基。（肽链数目）

DNFB法分析N-端氨基酸残基

4.采用特异性的酶（如胰蛋白酶）或化学试剂（如溴化氰）将蛋白质裂解成为长短不一的若干条肽段（至少作两套）。

干扰素 的质量分析