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Chromatography

Chromatography. 一、色谱分析法概述. 美国气相色谱仪. HP 高压液相 色谱仪. 国产气相色谱仪. 一、概论. （一）色谱分析法的历史. 俄国植物学家 Tswett 于 1901 年 发现：利用吸附原理分离植物色素. 1903 年 发表文章： On a new category of adsorption phenomena and their application to biochemical analysis 1906 年 Tswett 创立“ chromatography”—“ 色谱法”新名词

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  1. Chromatography 一、色谱分析法概述 美国气相色谱仪 HP高压液相色谱仪 国产气相色谱仪

  2. 一、概论 （一）色谱分析法的历史 俄国植物学家Tswett于1901年发现：利用吸附原理分离植物色素 1903年发表文章：On a new category of adsorption phenomena and their application to biochemical analysis 1906年Tswett 创立“chromatography”—“色谱法”新名词 1907年在德国生物会议上第一次向世界公开展示显现彩色环带的柱管

  3. 1930年R.Kuhn用色谱柱分离出胡萝卜素 • 1935年Adams and Holmes 发明了苯酚-甲醛型离子交换树脂，进一步发明了离子色谱 • 1938年Izmailov 发明薄层色谱 • 1941年Martin & Synge 发明了液-液分配色谱 • 1944年Consden,Gordon & Martin 发明纸色谱 • 1952年Martin & Synge 发明气-液色谱 • 1953年Janak发明气-固色谱 • 1954年Ray发明热导检测器 • 1957年Martin & Golay 发明毛细管色谱

  4. 1959年Porath & Flodin 发明凝胶色谱 • 1960年液相色谱技术完善 • 1954年我国研究成功第一台色谱仪 （二）色谱方法的分类 定义：色谱分离技术是借助色谱分离原理而使混合物中各组分分离的技术；将色谱分离技术应用于分析化学，称为色谱分析。

  5. 色谱法的分类 ①按物理状态分类 根据流动相的物态：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC) 根据固定相的物态：气-固色谱法、气-液色谱法、液-固色谱法、液-液色谱法 ②按使用的形式分类 (1)柱色谱、(2)纸色谱、 (3)薄层色谱 ③按分离机理分类 (1)吸附色谱、 (2)分配色谱、 (3)离子交换色谱、 (4)凝胶色谱

  6. 3.色谱法的特点 (1)高选择性 、(2)高效能、 (3)高灵敏度可以分析质量分数为10-6～10-9数量级、检出限量低至10-1l g的物质，适于微量和痕量分析、 4.色谱法的应用 (1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析； (2)液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。 (3)色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术，常用于制备分离，得到高纯样品。 (4)色谱—质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。

  7. 二、气相色谱分析Gas Chromatography,GC （一）气相色谱法的特点 ①高效能 填充柱都有几千块理论塔板 毛细管柱可达104块～105块理论塔板，可以分析沸点十分相近的组分和极为复杂的多组分混合物 ②高选择性 可分离同系物、同分异构化合物。

  8. ③高灵敏度 可以检测出10-11g～10-13g物质 痕量杂质分析：可以测出超纯气体、高分子单体、高纯试剂中质量分数为10-6～10-10数量级的杂质 大气污染物分析：可以直接检出质量分数为10-9数量级的痕量毒物 农药残留物的分析：可以检出农副产品、食品、水质中质量分数为10-6～10-9数量级的氯、硫、磷化合物 ④分析速度快 一般分析可在几分到几十分内可以完成，某些快速分析1s内可以分析数个组分。

  9. （二）气相色谱法的基本概念 1．色谱常用术语 ①色谱图 各组分的浓度随流出时间而分布的曲线称为色谱曲线，常称为色谱曲线图或色谱图。

  10. ②基线 没有试样进入检测器时，记录仪记录的是一条直线，这条直线称为基线。 噪音：使基线发生细小的波动的现象 基线是在实验操作条件下，反映检测器系统噪声随时间变化的曲线。 ①色谱峰的高度、宽度、半峰宽度 ★★峰高(h)：峰高h指色谱峰最高点到基线的距离，一般用cm为单位。

  11. ★★峰宽(Y)与半峰宽[Y1/2) 从色谱峰两侧的转折点(拐点)作切线，在基线上的截距叫峰底宽(y)；简称峰宽；峰高一半处色谱峰的宽度叫半峰宽(y1/2)。由于色谱峰顶呈圆孤形，色谱峰的半峰宽并不等于峰底宽的一半。

  12. 例4.2.1 已知记录纸的速度是2.5cm·min-1，测得某色谱峰的峰底宽度为3.2cm，用时间表示的色谱峰宽度为多少? 解： 3.2cm÷(2.5cm·min-1)＝1.28min 答：色谱峰的宽度为1.28min。 ⑤保留值：表示被测组分从进样到色谱柱后出现浓度最大值所需要的时间(或所需载气的体积)，叫做保留值。

  13. ★ ★保留时间(tR):是指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需的时间，=组分在流动相中停留的时间 +在固定相中所停留的时间 ★ ★调整保留时间(tR′)：组分的保留时间与死时间的差值： tR′=tR-t0 它表示与固定相发生作用的组分比载气在色谱柱中多滞留的时间，实际上是组分在固定相中所滞留的时间。

  14. ★ ★死体积（V0）：不与固定相作用的组分从进样到柱后出现浓度最大值所需要的载气体积。若载气的体积流速为F0，则死体积为 V0=F0·t0 ★ ★保留体积（VR）：从进样开始到柱后出现浓度最大值所需要的载气体积 VR=F0·tR ★ ★调整保留体积（ VR′ ）：指扣除死体积后的保留体积 VR′= t0′·F0

  15. ★相对保留值( ) 表示组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比： 值越大，两组分的色谱峰相距越远，分离得越好 2.分配系数与分配比 定义：组分在固定相和流动相之间发生的吸附与脱附或者溶解与挥发的过程叫分配过程。

  16. ★★分配系数(K):当组分在流动相和固定相两相中达到分配平衡时，组分在两相中的浓度之比，称为分配系数(K)：★★分配系数(K):当组分在流动相和固定相两相中达到分配平衡时，组分在两相中的浓度之比，称为分配系数(K)： 组分在固定相中的质量浓度(g·mL-1) 组分在流动相中的质量浓度(g·mL-1) K↑溶解度或吸附能力↑，组分在固定相中的量↑，在气相中的量↓。K↑进入固定相的组分↑，组分在固定相中滞留的时间越长，流出色谱柱所需的时间也就越长。

  17. ★ ★分配比(k) 定义：分配比是在一定温度、压力下，组分在两相间达到分配平衡时，两相间组分的质量比： k=ms/mm 分配比又称为容量因子或容量比 分配比k的大小由下式计算： k=tR`/t0 通过实验来测定分配比k的数值 k值越大，保留时间越长。k =0的组分，其保留时间即为死时间。

  18. ★★分配系数与分配比的关系 相比：表示流动相体积与固定相体积之比

  19. （三）气相色谱法的基本理论 • 1.塔板理论 • 假设： • 将一根色谱柱视为一个精馏塔 • 色谱柱是由一系列连续的、水平的塔板构成 • 每一块塔板的高度为H • 组分气体以脉冲的方式进入塔板 • 组分在每一块塔板上迅速达到分配平衡 • 分配系数在各塔板上是常数 • 气体的纵向扩散可以忽略不计

  20. ①色谱峰的形状 理论上：应得到正态分布的平滑曲线

  21. ②混合组分的分离

  22. ③色谱柱的柱效能 塔板高度： H=L/n 色谱柱长 理论塔板数 ★★同长度的色谱柱塔板数越多，塔板高度H越小， 分离效果越好。 色谱柱的理论塔板数按下式计算：

  23. ★★保留时间越长，Y或Y1/2越小，色谱峰越窄，理论塔板数越多，组分在两相间达到分配平衡的次数也越多，分离能力越强，柱效也就越高。★★保留时间越长，Y或Y1/2越小，色谱峰越窄，理论塔板数越多，组分在两相间达到分配平衡的次数也越多，分离能力越强，柱效也就越高。 例4.2.2 某色谱柱长2.1m，测得某组分的保留时间为5min42s，在色谱纸上量得色谱峰的宽度为1.2cm，已知纸速为2cm·min-1，求塔板高度。 解：将色谱峰的宽度换算成时间：

  24. 答：塔板高度为1.45cm。

  25. 有效塔板数：使用调整保留时间tR′计算塔板数：有效塔板数：使用调整保留时间tR′计算塔板数： 有效塔板数扣除了死时间的影响，较为真实地反映了柱效能的好坏。 塔板理论的优点：理论直观，能解释流出曲线的形状和浓度极大点(色谱峰)的位置，应用广泛。 缺点：理论建立在几点假设之上，不能解释塔板高度量受哪些因素的影响，也不能指出降低塔板高度的途径。

  26. 2.速率理论 范第姆特方程式： H=A+B/U+CU ☆☆☆式中：U为流动相平均线速度，A为涡流扩散项，B/U为分子扩散项，CU为传质阻力项。减少A，B/U，CU三项的值，可以降低塔板高度量，减少色谱峰的扩张，提高柱效。 ①涡流扩散项(A)：A 的大小，与填充物的平均颗粒直径dp(单位为cm)有关，也与固定相填充不均匀因子有关：

  27. ②分子扩散项(B/U) 试样分子沿色谱柱纵的方向扩散，系数B的大小与气体路径弯曲因子γ和组分在气体中的扩散系数Dg(单位为cm2.s-1)有关： 毛细管柱：γ=1 填充柱： γ＜1

  28. ③传质阻力项(CU) 定义：被测组分由于浓度不均匀而发生物质迁移过程，称为传质过程。 C称为传质阻力系数。 传质过程分为：气相传质过程与液相传质过程 传质阻力系数C等于气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl之和： C=Cg+C1

  29. 总结：范第姆特方程 H=A+B/U+CU A，B/U，CU越小，色谱柱的塔板高度H 越小，柱效率越高。 改善柱效率的因素： ★选择颗粒较小的均匀填料 ★★选用较低的柱温操作 ★★★降低担体表面液层的厚度 ★★★★选用合适的载气及载气流速：流速较小时，分子扩散项成为色谱峰扩张的主要因素，宜用相对分子质量较大的载气；流速较大时，传质项为控制因素，宜用相对分子质量较小的载气。

  30. （四）色谱分离条件的选择 1.分离度和影响分离的因素 ①分离度R及的计算 定义：两相邻组分保留时间之差与两峰底宽度和之半的比值： 色谱柱的选择性越强，两组分的色谱峰相距越远；柱效能越高，色谱峰越窄。

  31. R＝1时，分离程度为98.7% R＝1.5时，分离程度可达99.7% R＝1.5作为完全分开的标志 若两组分分离效果较差，可用半峰宽(Y1/2)代替峰底宽(Y)计算分离度：

  32. ②色谱分离基本方程式 由上式可知： (1)增加塔板数可以提高分离度 (2)k值的最佳范围是：1＜k＜10 (3)相对保留值γ增大，能显著地提高分离度 两根同种色谱柱的相互关系式：

  33. 例4.2.3 如果柱长L2为1m时，分离度及为0.8，要实现完全分离(R＝1.5)，色谱柱Ll至少应有多长? 答：色谱柱至少应有3.52m长。 例4.2.4 用3m长的填充柱得到如图4.2.6所示的色谱流出曲线，为了得到R＝1.5的分辨率，填充柱最短需要多少米?

  34. 解： 塔板高度为： 代入公式，得：

  35. 2.分离条件的选择 ①载气及其最佳流速的选择 ★ 载气的选择 热导池检测器常用氢气、氦气作载气 氢火焰检测器宜用氮气作载 ★载气流速的选择 范第姆特方程式H=A+B/U+CU中，A，B，C与载气线速度无关。 载气的最佳流速：

  36. ②柱温的选择 柱温改变时，柱效率、分离度R、选择性及色谱柱的稳定性都将产生相应的改变。 ③汽化温度的选择 比汽化室高30～70℃ 或：比试样组分中最高的沸点高30～50℃ ④进样时间和进样量 在0.1s内把试样样进完 液体进样量为0.1μL～5μL 气体进样量为0.1mL～5mL

  37. （五）固定相及其选择 1．气—固色谱固定相 吸附——物理化学过程 吸附剂分类： (1)非极性吸附剂：如活性炭，适用于低沸点的碳氢化合物的分析。 (2)弱极性吸附剂：如氧化铝吸附剂，适用于分析C1～C4烃类及异构体。 (3)强极性吸附剂：如分子筛，适于分析N2，O2，CO，H2等气体和正异构烷烃。 (4)氢键型吸附剂：如硅胶吸附剂，适用于分析有氢键或极性的化合物。

  38. 2.气-液色谱固定相 气-液色谱的优点： (1)固定液的品种繁多，可选择范围大； (2)固定液的用量可以任意变化；可以根据需要选用合适的固定液用量，以改善分离效果； (3)气-液色谱在通常操作条件下有良好的对称峰； ⑷寿命长。 ①担体 担体的作用是提供一个很大的惰性表面，使固定液以薄膜状态分布在其表面上 有白色硅藻土担体和红色硅藻土担体两类

  39. ★担体的选择的基本原则 (1)固定液用量在5%以上的，采用硅藻土型担体；固定液用量在5%以下的，采用表面处理过的担体。 (2)高沸点组分的分离，由于控制的柱温(色谱柱温度)较高，使用玻璃微球作担体。 (3)对高腐蚀性的组分，应选用抗腐蚀性强的聚四氮乙烯担体(氟担体)。 担体的粒度常选用60目~80目或80目~100目，高效柱可选用100目~120目。 ①固定液 ★对固定液的要求： (1)难以挥发，热稳定性好。 ⑵在工作柱温下，固定液粘度小，能均布在担体表面上形成液膜。

  40. (3)对被测组分有一定的溶解度且有较高的选择性。(3)对被测组分有一定的溶解度且有较高的选择性。 ⑷化学稳定性好，在操作条件下，固定液不与载气、担体、被测组分发生不可逆的化学反应。 ★固定液的分类 主要是按固定液的极性分级： “0”级——非极性固定液 “+1”与“+2”级——弱极性固定液 “+3”级——中等极性固定液 “+4”与“+5”级——强极性固定液

  41. ★固定液的选择原则： (1)非极性试样，用非极性固定液； (2)极性试样，使用极性固定液； (3)极性与非极性的混合物，一般选用极性固定液； (4)能形成氢键的试样，选用极性或形成氢键的固定液； (5)复杂的多组分混合试样，常用两种或两种以上的混合固定液。

  42. （六）气相色谱仪 1.气相色谱议的基本部件与作用 ①气相色谱仪的工作过程 气相色谱仪分为：载气系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统共五个主要组成部分

  43. ★进样系统

  44. 2.气相色谱检测器 气相色谱检测器可分为浓度型检测器与质量型检测器：浓度型检测器的响应值和组分的浓度成正比，质量型检测器的响应值和单位时间内进入检测器的质量成正比。 常用的浓度型检测器有：热导池检测器(TCD)、电子捕获检测器(ECD) 常用的质量型检测器有：氢火焰电离检测器(FID)、火焰光度检测器(FPD)

  45. ①热导池检测器的结构及测量原理 热导检测器的依据是组分和载气分别具有不同的热导系数，它的特点是结构简单，稳定性好，操作容易，灵敏度适中，对无机试样和有机试样都能响应，是应用最广泛、最成熟的一种通用型检测器。

  46. ②氢火焰检测器的结构原理 特点：灵敏度比热导池检测器高出三个数量级，具有结构简单、灵敏度高、响应速度快、应用广泛，适宜于痕量分析。 离子化机理：有机物在氢火焰中发生化学电离 火焰中的正离子以H3O+最多，约占90%；其他还有CHO+，CH3O+，C3H+等。 对在氢火焰中不电离的无机化合物，例如CO，CO2，SO2，N2等，不能进行检测。

  47. 3.检测器的性能指标 气相色谱分析对检测器的要求:测量准确，响应快，稳定性好，灵敏度高，适应范围广。 衡量检测器性能的主要指标:灵敏度、检测限和检测器的线性范围。 ①灵敏度 以响应信号R对进样量Q作图，得到一条通过原点的直线，其斜率为：

  48. (1)对于浓度型检测器 (2)对于质量型检测器 质量型检测器的灵敏度与载气的流速无关

  49. ②检测限(敏感度) 检测限D定义为某组分的峰高(mV)恰为噪音的2倍时，单位体积(或时间)引入检测器的试样量。 浓度型检测器 质量型检测器 检测限D越小，说明噪音越小，检测器的灵敏度越高，所需的试样量越少。

  50. 例4.2.6 为到定氢焰检测器的灵敏度，注入含苯0.05%(体积分数)的CS2溶液1μL，苯的色谱峰高为10cm，半峰宽为0.5cm，记录纸速为1cm.min-1，记 录纸的灵敏度为0.2mV.cm-1，检测器噪音为0.02mV。计算该检测器的灵敏度和检测限。 解：氢焰检测器为质量型检测器，因此应用公式： 常温下，苯和CS2均为液体，查得液体苯的密度为 0.879g·mL-1=879mg·mL-1，苯的质量为：

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