1 / 18

根癌农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化

植物生物技术实验. 根癌农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化. 实验五. 2012 年 4 月 17 日. 植物遗传转化. 植物遗传转化：外源基因转移到植物体内并 稳定整合、表达与遗传 的过程。 常用方法： 农杆菌介导法 基因枪法 花粉管通道法 ……. 根癌农杆菌介导法. 细菌； 能够感染植物特别是 双子叶植物； 含有一个以上的质粒（ Ti 质粒，核外遗传单位）；感染植物后， Ti 质粒的 DNA 片段导入植物基因组中。. Ti 质粒. Ti 质粒：环状 DNA 分子，包括 T-DNA 区 ；两端各有 25bp 的边界序列；

franz
Download Presentation

根癌农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 植物生物技术实验 根癌农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化 实验五 2012年4月17日

  2. 植物遗传转化 • 植物遗传转化：外源基因转移到植物体内并稳定整合、表达与遗传的过程。 • 常用方法： • 农杆菌介导法 • 基因枪法 • 花粉管通道法 • ……

  3. 根癌农杆菌介导法 • 细菌； • 能够感染植物特别是双子叶植物； • 含有一个以上的质粒（Ti质粒，核外遗传单位）；感染植物后，Ti质粒的DNA片段导入植物基因组中。

  4. Ti质粒 • Ti质粒：环状DNA分子，包括 • T-DNA区；两端各有25bp的边界序列； • Vir 区，调控T-DNA加工和转移；分VirA、B、C、D、E、G、H 等7-8个操纵子，一共有24个基因； • Con区，调控细菌间结合转移的相关基因； • Ori 区，调控Ti质粒的自我复制起始。 • Vir区、根癌农杆菌染色体上的毒性相关位点和T-DNA边界序列是T-DNA转移必需的。

  5. T-DNA整合过程 农杆菌附着在植物伤口，形成纤维小丝固定在植物细胞壁 受伤的植物形成酚类等诱导物质 一系列Vir基因表达；剪切T-DNA（从右边界到左边界）并最终形成T-链蛋白复合体 T-链蛋白复合体经细菌细胞膜、细胞壁、植物细胞壁、细胞膜、核膜进入细胞核，以单或多拷贝形式随即整合到植物染色体 T-DNA表达，植物产生冠瘿瘤

  6. 根癌农杆菌介导法 外源目的基因 真核生物启动子 选择基因 报告基因 体外连接到质粒中 质粒转化进入根癌农杆菌 农杆菌感染植物外植体 选择基因：选择性标记基因，给予转基因植物抗性，非转基因细胞死亡，抗生素抗性基因和除草剂抗性基因。 报告基因：快速报告植物材料是否被转化，表达产物非常容易被检测的基因，常用GUS（β-葡萄糖醛酸苷酶基因）、GFP（绿色荧光蛋白基因）等。 真核生物启动子：用于目的基因、选择报告基因在宿主细胞的启动表达，一般为花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子

  7. 选择基因 真核启动子 报告基因

  8. 农杆菌介导的基因工程基本程序 载体构建 （目的基因、筛选报告基因、启动子连接到T-DNA） 载体向农杆菌转化 受体植株材料（叶盘） 含有目的载体的农杆菌 农杆菌侵染植物 共培养 脱菌培养 形成愈伤组织/不定芽/体细胞胚 筛选培养 植株再生 检测 转基因植株

  9. 重点步骤 1、农杆菌的培养与侵染菌液的制备 • 培养基：YEP、YEB、LB，加Kan • 培养天数：对数生长 • 侵染菌液：离心收集，以培养基稀释，OD600=0.05~0.7 2、植物受体材料的准备 • 叶片、愈伤组织、胚轴、子叶等，敏感细胞 • 预培养（适应离体环境，非必须） 3、侵染 • 将切割成小块的外植体浸泡在制备好的菌液中，（以无激素MS或无菌水漂洗后）放在无菌吸水纸上吸干 • 侵染时间：数分钟

  10. 重点步骤 4、共培养 • 诱导物：乙酰丁香酮AS，Vir区基因活化物 • 时间：>16h才能诱发毒性反应，过长毒害 • 暗培养 5、筛选培养： • 筛选培养：选择标记基因，Kan，筛选转基因细胞 • 脱菌培养：杀死和抑制农杆菌，含有能杀死农杆菌的抗生素的培养基，常用羧苄青霉素Carb 6、再生植物的检测 • 报告基因等

  11. 转基因是否成功的检测方法 1、选择基因在培养阶段的筛选作用 2、报告基因的初步检测 3、分子检测 • 基因水平：PCR检测、Southern Blot ； • RNA水平：RT-PCR，Northern Blot； • 蛋白质水平：表达蛋白的分离纯化，血清学反应、Western Blot； 4、性状分析

  12. 报告基因检测

  13. 分子检测 PCR检测：以目的基因为引物，以转基因植物基因组DNA为模板进行体外扩增

  14. 分子检测 Southern Blot 检测：以外源目的基因序列作为探针，与转基因植物基因组DNA进行杂交。检测外源基因的存在及其拷贝数

  15. 分子检测 RT-PCR检测：以转基因植物总RNA为模板进行反转录，在经PCR扩增，如果从细胞总RNA得到特异的cDNA扩增条带，则表明外源基因实现了转录

  16. 思考题： 1、高效遗传转化体系建立的基础是？ 高效遗传表达载体的选择和载体构建 受体再生及转化体系的建立和优化 2、根癌农杆菌介导的遗传转化的影响因素有哪些？ 农杆菌：基因型、制备、保存 受体材料：基因型、生理状态 转化过程：预培养，侵染（方式、时间、浓度），共培养（培养基、温、光、pH、激素、诱导物）

More Related