Выделяют следующие основные факторы, обеспечивающие обособление видов:

1. Использование методов культуры клеток и тканей растений in vitro для преодоления межвидовых репродуктивных барьеров

2. Наиболее эффективным методом расширения генетической базы селекционного материала является гибридизация его с дикими и примитивными культурными родственными видами (отдаленная гибридизация). В селекции нашло отражение два основных направления использования отдаленной гибридизации: с целью расширения генетической базы соответствующего культурного вида (расширения аллельного разнообразия) для интрогрессии в селекционный материал отдельных ценных генов.

3. Выделяют следующие основные факторы, обеспечивающие обособление видов: - внешние экологические барьеры: физическое разделение популяций видов в пространстве и времени (несовпадение периода цветения), обусловленное их адаптацией к специфическим экологическим нишам; - геномные различия между видами; - различия в плоидности; - внутренние барьеры, препятствующие гибридизации (пре- и постзиготные репродуктивные барьеры).

4. Презиготная несовместимость Презиготные барьеры (несовместимость) проявляются между опылением и оплодотворением в виде: непрорастания пыльцы на рыльце пестика; прорастания, но не сопровождающегося проникновением пыльцевой трубки в ткани пестика; проникновения трубки в ткани пестика, но при котором имеет место ингибирование роста пыльцевой трубки в разной степени и в разных частях столбика или в завязи

5. Постзиготные барьеры Постзиготные межвидовые барьеры проявляются в ходе или после оплодотворения, в течение процесса роста и развития, цветения растений F1, или даже позднее в расщепляющихся поколениях F2 и BC1

6. Группировка видов Solanumв соответствии с их плоидностью и EBN (по Hermsen 1994)

7. Опыление in vitro для преодоления межвидовой несовместимости Впервые этот метод был успешно применен индийскими учеными [Kanta et al., 1962] для получения самоопыленного потомства у самонесовместимого мака Papaversomniferum Метод включает: - обнажение семяпочки или семяпочек путем удаления тканей пестика и завязи, - нанесение на них пыльцы - культивирование оплодотворенных семяпочек на питательной среде до образования зрелых семян Варианты метода: опыление и культивирование - изолированных завязей, - семяпочек, прикрепленных к плаценте, - семяпочек без плаценты

8. Применение эмбриокультуры для устранения последствий постгамной межвидовой несовместимости Первым продемонстрировал возможности использования культуры изолированных зародышей для целей преодоления межвидовых репродуктивных барьеров у льна Laibach (1925, 1929) Зародыши вычленяют в стерильных условиях из гибридных семян, помещают их на питательную среду и при культивировании на свету добиваются регенерации из них растений. Эффективность регенерации растений в культуре зародышей в значительной степени зависит от размера эксплантата и стадии развития зародыша: чем больше эксплантат и чем более зрелый зародыш, тем выше вероятность регенерировать из него растение

9. Получение межвидовых гибридов путем слияния протопластов для интрогрессии ценных генов в селекционный материал Первая методика слияния протопластов, основанная на применении нитрата натрия, была разработана в лаборатории Э. Кокинга в Ноттингемском университете [Power et al., 1970, Evans, Cocking, 1975]. С помощью этой методики в США в 1972 г были получены первые растения соматических гибридов между разными видами табака (Nicotianaglauca+N. langsdorffii) [Carlson et al. 1972]

10. Соматическая гибридизация Технология соматической гибридизации включает следующие этапы: - получение суспензий протопластов двух видов растений, гибриды между которыми предполагается получить, - получение смешанной суспензии протопластов двух видов и использование экспериментальных воздействий (химических или электрических), обеспечивающих слияние протопластов, - отбор продуктов слияния, - получение из них каллюсной культуры и регенерация растений соматических гибридов, - подтверждение гибридностирастений-регенерантов

11. Соматическая гибридизация Химическое слияние: в качестве первого «фьюзогена» использовали NaNO3 [Power et al., 1970]. Позднее были предложены менее токсичные и более эффективные воздействия. Наибольшее распространение получили следующие системы слияния протопластов: - высокая концентрация в среде ионов Ca2+ (около 50 мМ) и высокая рН (9-11) при 37оС [Keller, Melchers, 1973]; - добавка в среду полиэтиленгликоля (ПЭГ) [Kao, Michayluk, 1974; Wallin et al. 1974]; - сочетание ПЭГ + высокая концентрация ионов Ca2+ и высокая рН. Полиэтиленгликоль используют молекулярной массой 1500-6000 в концентрации 15-45%, продолжительность воздействия 15-20 мин. Его применение обеспечивает высокую частоту слияния протопластов (выше 30%) большого числа видов растений.

12. Соматическая гибридизация Метод электрослияния протопластов растений впервые был предложен Zimmermann, Scheurich (1981). Электрослияние осуществляют в специальной кювете прибора с двумя электродами, расстояние между ними 0,2 мм. Через питательную среду, в которую помещают суспензию протопластов двух видов, пропускают высоковольтные импульсы (синусоидальная волна; расстояние между пиками 5-10 В; частота 500 кгц; напряжение от 200 В до 350 В, длительность импульса ~50 мс;). Под действием тока на электродах образуются агрегаты из 2-3 протопластов, либо цепочки из 5÷6 протопластов между электродами. В это время на электроды подают единичные импульсы постоянного тока, которые приводят к образованию пор в сильно сжатых мембранах протопластов. В результате происходит перемешивание цитоплазмы контактирующих протопластов и образуются гибридные протопласты.

13. Соматическая гибридизация Методы отбора продуктов слияния протопластов: Механическая изоляция Генетическая комплементация Физиологическая комплементация Инактивация протопластов одного из родителей до слияния протопластов Физическое обогащение

14. Соматическая гибридизация Симметричные соматические гибриды Асимметричные соматические гибриды Цибриды. Подтверждение гибридностирастений-регенерантов, полученных после слияния протопластов: исследование морфологических признаков оценка селекционной ценности гибридов анализ изоферментов анализ ДНК-маркеров, в том числе видоспецифичных маркеров отдельных хромосом, генов родительских видов цитогенетические методики

15. Проблемы беккроссирования соматических гибридов культурным родителем - Сильные геномные различия родительских видов (соматические гибриды – аллополиплоиды) - Различия в плоидности соматических гибридов и культурного родителя - Презиготная несовместимость соматических гибридов с культурным родителем - Постзиготные репродуктивные барьеры при гибридизации соматических гибридов с культурным родителем

16. Проблемы беккроссирования соматических гибридов культурным родителем При использовании соматических гибридов в качестве материнской формы беккроссирование не может быть успешным, так как в пестиках таких гибридов присутствуют РНКазы, которые являются продуктами S-генов обоих родительских видов). S-РНКазы дикого вида не могут быть дезактивированы ингибиторами РНКаз, присутствующими в пыльцевых трубках S. tuberosum, что приводит к развертыванию реакции несовместимости

17. Расщепление по S-локусу в результате мейоза у соматических гибридов S. tuberosum +S. pinnatisectum(tbr+pnt) S-локус Гаметы соматического гибрида SpntSpntSpnt SpntмейозSpntStbr StbrStbrStbr Stbr

18. Подходы к преодолению презиготной несовместимости и культурного родителя - Использование соматических гибридов в беккроссах в качестве опылителя - Получение дигаплоидов соматических гибридов с помощью гаплопродюсера - Получение удвоенных дигаплоидов соматических гибридов с помощью культуры пыльников

19. Дигаплоиды соматических гибридов (2n=2x=24) S.tuberosum+S.pinnatisectum

20. Образование каллюса в культуре пыльников соматических гибридов (2n=4x=48) S.tuberosum+S.bulbocastanum

21. Регенерация растений в культуре пыльников соматических гибридов (2n=4x=48) S.tuberosum+S.bulbocastanum

22. Соматические гибриды tbr+blb (слева) и андрогенетические растения-регенеранты соматических гибридов (удвоенные дигаплоиды (2n=4x=48)