Bệnh Tay chân miệng Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm

1. Bệnh Tay chân miệngKỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm Tháng 7 năm 2011 TTYTDP Tiền giang

2. Giới thiệu bệnh tay chân miệng • HFMD=Hand-Foot-and-Mouth Disease: HC Tay-Chân-Miệng Gây ra do virus đường ruột nhóm A (HEV-A) : * Enterovirus 71 * Coxsackie virus, group A type 6, 10, 16. Bệnh thường nhẹ tự khỏi sau 1 tuần , nhưng EV71 liên quan nhiều đến biiến chứng thần kinh đôi khi tử vong .

3. Hình ảnh bệnh tay chân miệng

4. Giới thiệu về Vi rút đường ruột : • Vi rút đường ruột là nhóm có nhiều thành viên nhất , quan trọng trong y học và chăn nuôi. • Là một trong các vi rút có kích thước nhỏ nhất 20-30 nm. • Bên trong chứa sợi đơn RNA dài 7500 Nucleotides, là thành phần di truyền, nhân lên và gây nhiễm của Vi rút • Vi rút nhân lên ở bào tương của tế bào bị nhiễm • .Các yếu tố ảnh hưởng trên vi-rút • Virus bị bất hoạt bởi nhiệt 56oC/ 30 phút, tia cực tím, tia gamma. • Virus chịu được pH với phổ rộng 3-9. • Bị bất hoạt bởi: 2% Sodium hydroxide, Chlorine tự do. • Không hoặc ít bị bất hoạt bởi các chất hòa tan lipid như: Cồn, Chloroform,Phenol, Ether. • Virus tăng chịu nhiệt trong môi trường chứa MgCl2

5. Dịch tễ • Nguồn truyền nhiễm : • Người bệnh, người vừa khỏi bệnh, người nhiễm vi-rút không triệu chứng. • Cách lây truyền: • Qua đường phân-miệng, các giọt nhỏ qua không khí, dịch tiết, qua trung gian tay bẩn, đồ dùng, nước, chất thải. • Thời gian đào thải vi-rút: • Vi-rút ở dịch tiết trong họng: 1-2 tuần • Vi-rút ở phân: nhiều tuần, đôi khi vài tháng.

6. Bệnh phẩm Các loại bệnh phẩm: • Dịch ngoáy họng: phải lấy sớm cần MTVC, yêu cầu phải lấy đúng kỹ thuật. • Dịch bóng nước: rất đặc hiệu, đôi khi quá ít khó lấy, cần MTVC • Phân: tỉ lệ dương tính cao, phải cho bệnh nhi nhập viện đến khi lấy được mẫu phân, không cần MTVC. • Phết trực tràng : Khi không lấy được mẫu phân. • Dịch não tủy : Khi có biến chứng thần kinh, tỉ lệ dương tính rất thấp. Để gia tăng tỉ lệ phát hiện nhiễm vi rút, 1 bệnh nhi cần lấy ít nhất 2 loại bệnh phẩm : - Ngoáy họng và bóng nước ( nếu có ) - Ngoáy họng và phân ( hoặc phết trực tràng ) Thời điểm lấy bệnh phẩm: Ngay sau khi có chẩn đoán

7. Các xét nghiệm chẩn đoán bệnh TCM • RT PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) để phát hiện ARN và xác định vi-rút. • Cấy phân lập vi-rút trên tế bào RD, Vero v.v… • Định danh bằng phản ứng trung hòa trên nuôi cấy tế bào dùng các kháng huyết thanh đặc hiệu.

8. SƠ ĐỒ THỰC HIỆN XÉT NGHIỆM ENTEROVIRUS MẪU BỆNH PHẨM (DNT, PHÂN, NGOÁY HỌNG, BÓNG NƯỚC) RT – PCR ENTEROVIRUS DƯƠNG TÍNH ÂM TÍNH KL: ÂM TÍNH VỚI ENTEROVIRUS RT – PCR ENTEROVIRUS 71 NUÔI CẤY PHÂN LẬP ÂM TÍNH DƯƠNG TÍNH KL: NHIỄM ENTEROVIRUS 71 ĐỊNH TYPE ENTEROVIRUS BẰNG KHÁNG THỂ TRUNG HÒA KẾT LUẬN: KẾT QUẢ

9. Xác định vi rút đường ruột bằng kỹ thuật RT-PCR • Bằng cặp mồi đặc hiệu cho vùng gen 5’UTR trong RNA của nhóm các vi-rút đường ruột • Enzyme reverse transcriptase và enzyme Taq polymerase tổng hợp đoạn gen đặc hiệu của vi-rút đường ruột và nhân lên số lượng lớn bản sao • Phát hiện bằng Ethidium Bromide dưới tác dụng của tia UV với kích thước tương ứng.

10. Xác định Enterovirus 71 bằng kỹ thuật RT-PCR • Bằng cặp mồi đặc hiệu cho vùng gen VP1 trong RNA của nhóm EV 71 • Enzyme reverse transcriptase và enzyme Taq polymerase tổng hợp đoạn gen đặc hiệu của EV71 và nhân lên số lượng lớn bản sao • Phát hiện bằng Ethidium Bromide dưới tác dụng của tia UV với kích thước tương ứng.

11. Nuôi cấy phân lập vi rút đường ruột • Hai loại tế bào: RD-A ( tế bào ung thư cơ vân ở người ) và Vero ( tế bào thận khỉ). • Vi rút đường ruột sẽ xâm nhập vào tế bào gây hiện tượng hủy hoại tế bào. Tế bào bị virus hủy hoại hay hiệu ứng bệnh lý tế bào (CPE=cytopathic effect) Tế bào bình thường

13. CHUẨN BỊ VẬT LIỆU LẤY BỆNH PHẨM • Môi trường chuyên chở vi rút (MTCC) do Viện Pasteur TP.HCM cung cấp. Khi chưa dùng bảo quản ở 2-8oC hay ngăn mát tủ lạnh. Không dùng khi môi trường có màu đục hay chuyển từ màu hồng sang tím hoặc vàng. • Lọ đựng phân sạch, có nắp xoáy và muỗng múc. • Ống vô trùng 2-3 ml chứa DNT • Cây đè lưỡi • Đèn pin, tốt nhất là đèn gắn trước trán • Que bông cán nhựa ngắn, đầu cuốn bông sợi tổng hợp (không dùng que cán tre hay gỗ với bông sợi tự nhiên vì có thể chứa chất làm bất hoạt virus hoặc ức chế p/ư PCR) • Kéo cắt que bông, kẹp gắp (pince) • Bơm kim tiêm cỡ 5 ml, 23G x 1”.

14. CHUẨN BỊ VẬT LIỆU LẤY BỆNH PHẨM (tt) • Túi nylon chứa các tube BP. • Giá đựng lọ ngoáy họng • Túi nylon có thể hấp tiệt trùng để chứa đồ thải. • Dây thun khoanh. • Khăn giấy thấm mềm hoặc giấy vệ sinh. • Hộp cứng bằng nhựa có nắp xoáy (có thể dùng lọ thuốc đã hết) • Phích lạnh có sẵn các hộp nước đá đông băng. • Cồn 70% hoặc dung dịch khử trùng có chlorine (Sodium hypochlorite còn gọi là nước tẩy Javel bán ở thị trường 5%, pha 1/10 để có 0,5%), hoặc Chloramine B pha 2-5%. • Phiếu bệnh phẩm, nhãn, bút bi, bút dầu không phai mực.

15. Kỹ thuật lấy bệnh phẩm dịch bóng nước • Lau sạch vùng da chỗ có bóng nước bằng nước cất hay nước muối sinh lý, không dùng cồn hoặc chất tiệt khuẩn khác. • Bóng nước: dùng kim tiêm đâm thủng bóng nước và hút vào bơm tiêm. • Chà mạnh que bông để dịch bóng nước thấm vào bông, cho que bông vào môi trường vận chuyển.

16. Kỹ thuật lấy bệnh phẩm ngoáy họng • Chọn nơi có ánh sáng tốt hoặc dùng đèn chiếu sáng vào họng bệnh nhân. • Bệnh nhân ngửa cổ, lè lưỡi dài ra, nói chữ «AAA… » kéo dài để nâng lưỡi gà lên và họng mở rộng hơn. • Dùng cây đè lưỡi, cặp cùng lúc 2 tăm bông cho cứng, chà mạnh và thật nhanh ở thành sau họng BN một lần với 3-4 động tác đến khi bệnh nhân sắp nôn. Nếu BN há họng tốt, không cần đè lưỡi vì BN có thể có phản xạ nôn ngay khi đè lưỡi. • Không chạm vào vòm họng và lưỡi để tránh phản xạ nôn (không cần chà 2 bên vùng a-mi-đan như các hướng dẫn trước đây). • Động tác phải cẩn thận, nhanh và dứt khóat. • Cho 2 tăm bông vào cùng 1 lọ chứa môi trường chuyên chở vi rút.

17. HÌNH ẢNH NGOÁY HỌNG

18. Kỹ thuật lấy bệnh phẩm phân • Phân: - Nếu là phân sệt lấy với khối lượng bằng đầu ngón tay cái, Nếu là phân lỏng, lấy khoảng 10 ml cho vào lọ sạch • Nếu bệnh nhân táo bón, bơm glycerin để dễ đại tiện. • Không để nước tiểu dính vào phân • Ưu điểm: thu thập được nhiều vi khuẩn, vi-rút • Nhược điểm: không chủ động thời điểm lấy mẫu phân • Ngoáy trực tràng • Bệnh nhân nằm nghiêng 1 bên (trái), đùi gập sát bụng. • Người lấy BP dùng tay trái banh rộng hậu môn, tay phải luồn nhẹ và xoay que bông qua cơ vòng hậu môn vào trực tràng khoảng 2-3 cm để lấy phân từ trực tràng. • Rút tăm bông ra từ từ, kiểm tra phân dính ở tăm bông và cho ngay vào ống chứa môi trường chuyên chở vi-rút. • Ưu điểm: chủ động thời điểm lấy mẫu phân • Nhược điểm: thu thập được ít vi khuẩn, vi-rút

19. Bệnh nhân nằm nghiêng 1 bên (trái), đùi gập sát bụng. • Người lấy BP dùng tay trái banh rộng hậu môn, tay phải luồn nhẹ và xoay que bông qua cơ vòng hậu môn vào trực tràng khoảng 2-3 cm để lấy phân từ trực tràng

21. Cách đóng gói, bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm • Dùng khăn giấy hoặc giấy vệ sinh quấn quanh từng ống hoặc lọ BP, đặt trong 1 túi nylon (2 lớp), buộc (cột) chặt bằng 2 sợi dây thun khoanh, cho vào 1 hộp cứng để tránh bể vỡ. • Tất cả các BP lấy bằng que bông phải đặt trong MTCC, trừ phân, dịch não tủy. • Các ống BP phải đặt đứng thẳng. Kiểm tra ống BP để đảm bảo nắp đã được đậy chặt. • Giữ tạm BP ở tuyến cơ sở: +4oC/ ≤ 2 ngày trong phích lạnh có hộp đá ướt hoặc ngăn mát tủ lạnh. • Vận chuyển BP: +4oC bằng phích lạnh. • Báo cho Khoa xét nghiệm Trung tâm y tế Dự phòng TG, ĐT 073.3872368, biết trước khi chuyển bệnh phẩm. • Gửi bệnh phẩm kèm phiếu bệnh phẩm đến Khoa xét nghiệm Trung tâm y tế Dự phòng TG, số 158/3 Trần Hưng Đạo, phường 5, Mỹ Tho, TG.

23. Hộp lạnh (ice pack) Phích lạnh (ice box) Túi gel lạnh (ice gel)

24. Lưu ý về bảo quản mẫu • Để chẩn đoán vi-rút học phân tử • 4°C/ ≤ 48 giờ • -20°C/ 1 tuần • -70°C/ nhiều tháng • Để cấy phân lập vi-rút • 4°C/ ≤ 48 giờ • -70oC/ nhiều năm Chỉ được làm đông tan bệnh phẩm 1-2 lần

26. Trân trọng cảm ơn