1. Феномен ЦМС и восстановления фертильности пыльцы 2. Связь ЦМС с митохондриями

1. Лекция 10. ЦМС растений –  самая доходная митохондриальная мутация • 1. Феномен ЦМС и восстановления фертильности пыльцы • 2. Связь ЦМС с митохондриями • 3. Химерные гены в митохондриях и происхождение ЦМС • 4. Экспрессия ЦМС – генов • 5. Механизм действия ядерных генов-восстановителей • фертильности • 6. Ядерно-плазменный конфликт при ЦМС у пшеницы • 7. Природа дефектов, возникающих при ЦМС

2. Мужская стерильность растений(МС) генетически контролируемое нарушение развития пыльцы у растений стерильность пыльцы ГМС ЦМС Генная (гены ядра) Цитоплазматическая(гены органелл)

3. ЦМС описана более чем у 150 видов высших растений 47 родов 20 семейств По некоторым данным, ЦМС найдена более чем у 300 видов высших растений ЦМС широко используется в семеноводстве для получения гибридных семян – это самая «доходная» цитоплазматическая мутация, ежегодно приносящая многомиллионные прибыли

4. Каквозникают растения с ЦМС? 1. Спонтанно - обнаруживаются обычно при анализе больших популяций различных с/х культур. Нередко ЦМС-формы обнаруживаются у диких родичей культивируемых с/х растений 2. Наиболее часто формируются ЦМС-растения так называемой «гибридной природы».Цитоплазматической стерильность пыльцы возникает как результат ядерно-плазменной несовместимости при некоторых отдаленных скрещиваниях. Классические примеры стерильности второго типа: - аллоплазматические пшеницыTriticum aestivum на цитоплазме Aegilops ovataили Triticum timopheevi, - линии подсолнечникаHelianthus annuus на цитоплазме Helianthus petiolaris , - серия стерильных линий табакаNicotiana tabacum на цитоплазме N. repanda , - ЦМС-формы у различных видов рода Brassica.

5. Каквозникают растения с ЦМС? (продолжение) 3. ЦМС может возникнуть и в результате некоторых внутривидовыхскрещиваний а также присоматической гибридизации 4. У самоопыляющихся растений (бобовые), ЦМС-мутация сохраняется у множества диких форм в субстохиометрических количествах, а при определенных ядерно-плазменных комбинациях количество ее копий в митохондриях может возрасти в 1000-2000 раз и проявиться фенотипически. 5. Искусственное получение новых мужски стерильных форм производится также с использованием сомаклональной изменчивости, характерной для культур in vitro. Так были отобраны ЦМС-формы табака, риса, кукурузы, сорго.

6. Гены-восстановители фертильности В природных популяциях растений разных видов выявлены и продолжают выявляться ядерные гены Rf(restoration of fertility), восстанавливающие полностью или частично фертильность пыльцы В случае доминантных Rf генов фертильность восстанавливается уже в гибридах F1: rfrf(Sцит)x RfRf(Nцит) Rfrf (Sцит) цмс ферт ферт В некоторых случаях ЦМС восстанавливается с помощью не одного, а нескольких Rf генов

7. Почему причину ЦМС искали в митохондриях? Признак передавался по материнской линии Признак представлялся связанным с нарушением энергетических процессов в пыльниках (митохондрии???) Уже ранние цитохимические и электронно-микроскопические исследования, посвященные ЦМС, свидетельствовали о серьезных нарушениях в митохондриях стерильных растений Предположения о мутации в митохондриальной ДНК были сделаны на основе этих данных (60-е 70-е гг.)

8. В следующее десятилетие (1976-1985) были получены первые данные об отличии митохондриальных ДНК стерильных растений кукурузы от нормальных Было показано, что каждый тип стерильности – T, C и S - характеризовался своим уникальным спектром фрагментов мтДНК при эндонуклеазной рестрикции

9. Химерные гены в митохондриях и происхождение ЦМС При исследовании митохондриальной ДНК кукурузы с Т-типом ЦМС с помощью геномной библиотеки была обнаружена область, экспрессирующаяся во всех тканях стерильных растений иначе, чем у нормальных Так был впервые локализован ЦМС-ген T-urf13и его продукт – белок 13 кД

10. Химерный ген в митохондриях стерильных растений кукурузы Т-типа (техасского) 30н atp6 444н 291 кодон T-atp6 N-rrn26 T-ЦМС К образованию такого химерного гена привели не менее 7 рекомбинаций 56н 318 н 26S рРНК urf25 urf13221 кодон N-urf25 urf25 219 кодонов табак тРНКarg ? 5’-фланкирующая последовательность перед геном T-urf13 гомологична 5’-фланкирующей области atp6 гена – вероятно, промотор гена T-urf13 появился в результате дупликации участка мтДНК – промотора гена atp6 и дальнейшей рекомбинации последовательность неизвестного происхождения

11. У кукурузы выявлено 3 различных типа ЦМС, при всех этих типах обнаруживаются разные химерные гены Химерный ген мтДНК при С-типе стерильности составлен из «кусков» митохондриальных и пластидных ДНК coxII- atp6- -atp9 141 кодон У митохондрий кукурузы S-типа также были обнаружены мтДНК реорганизации, результатом которых явились два химерных гена orf355 orf77

12. Структура R -области мтДНК при ЦМС S-типа ??? последовательности Сходство с ntp9 геном R повтор (1060 пн) – сходство с R1 плазмидой Сходство сatp9геном

13. У Petunia c ЦМС связан участок мтДНК, называемый S-pcfлокус состоит из трех котранскрибируемых генов: pcf , nad3 иrps12 ЦМС-локус S-pcf у петунии Хп atpB фертильный nad3 rps12 S-atp9 S-pcf сox2-1 Urf S Последовательности обоих экзонов coxII присутствуют без интронов

14. Структура pvs – локуса у фасоли с ЦМС orf98 orf239 pvs Гомология с Гомология с Гомология с 3’-концом cox2хлоропластным3’-концом cob генатРНКАlaинтроном Область размером 3 kb содержит несколько открытых рамок считывания, образованных при рекомбинациях мтДНК

15. Структура ЦМС-локуса у подсолнечника cob atpA orf873 Ферт Инсерция инверсия 5 тпн11 тпн Стер orf873 cob atpA orf522 Не выявлено транскриптов Стрелки указывают направление транскрипции

16. Как осуществляется транскрипция при ЦМС? Химерные гены часто котранскрибируются вместе с нормальными pcfс nad3иrps12 (Petunia) orf224с atp6 (pol-Brassica) orf222 с участком генаnad5иorf139 (nap-Brassica) orf105c atp6 (редис) orf 522 с atpA (Helianthus)

17. В других случаях у химерных генов оказались собственные сайты инициации транскрипции переместились из других orf в результате реорганизаций мтДНК Например, промотор гена atp6 инициирует транскрипцию urf13 кукурузы и химерной orf риса с ЦМС-Bo Транскрипция ЦМС-локусов происходит по общим законам, с промоторов, уже существовавших в митохондриальных геномах

18. РНК-эдитинг и ЦМС T-urf13является единственным известным в настоящее время у высших растений белок-кодирующим митохондриальным геном, не подвергающимся РНК-эдитингу В химерных генах, состоящих из фрагментов разных генов, эдитинг происходит в позициях, точно соответствующих точкам редактирования полных транскриптов этих генов

19. Феномен транскрипт-специфической утраты РНК-эдитинга Описан только у сорго Подавление atp6 РНК-эдитинга наблюдалось как в спорофитных, так и в гаметофитных тканях пыльника, но ни в каких других В митохондриях пыльников линии Sorghum bicolor A3Tx398 (ЦМС) было избирательно подавлено редактирование транскриптаatp6 Феномен явно зависит от ядерного генома: у одних линий с такой же цитоплазмой atp6 пыльников нормально редактировались, у других - нет При этом транскрипты atp9, nad3, nad4, rps12 нормальноредактировались как в пыльниках,так и в этиолированных проростках

20. Трансляция ЦМС-генов ЦМС Изолированные митохондрии фертильн Синтез in vitro - Белок 13 кД Идентифицирован еще до описания гена urf13. Размер продукта гена urf13соответствовал уже известному белку 13 кД

21. На основе первичной последовательности гена urf13были синтезированы полипептиды Антитела к полипептидам реагировали с 13 кД белком в ЦМС линиях Аналогичным образом был найден ЦМС-белок у Petunia отсутствовал у фертильных аналогов полипептид 25 кД синтезировался изолированными митохондриями ЦМС-линий

22. ЦМС-белки кукурузы, петунии, подсолнечника выявляются во всех органах стерильных растений Белок фасоли pvs-ORF239 оказался специфичным только для репродуктивных тканей: семяпочек, материнских клеток пыльцы и микроспор мужски стерильных растений Модуляция экспрессии гена orf239 – первый известный случай посттранскрипционной регуляции в митохондриях растений

23. Модуляция экспрессии гена orf239 фасоли Репродуктивные ткани ORF239 мРНК orf239 Вегетативные ткани ORF239 Митохондриальная протеаза ORF239

24. Ген orf239 фасоливызывает стерильность при встраивании в ядерный геном табака несколько трансформантов характеризовались мужски-стерильным или полустерильным фенотипом иммуноцитохимический анализ обнаруживал белок ORF239 в клеточной стенке аномальных микроспор

25. Ядерные гены – восстановители фертильности: механизм действия Нарушение развития пыльцы у растений с мутантной цитоплазмой также может быть откорректировано специальными ядерными генами Rf – восстановителями фертильности Эта коррекция происходитна разных этапах – от репликации ДНК до взаимодействия с ЦМС-белками

26. 1. Эффект генов Rf на митохондриальный геном Ген-восстановитель фасолиFr приводит к изменению структуры митохондриальной ДНК: из генома митохондрий исчезает pvs последовательность Для полного исчезновения pvs – локуса и полного восстановления фертильности ген Fr должен быть в гомозиготном состоянии (FrFr) Одна доза гена (Frfr) инициирует процесс элиминации pvs – локуса и проявляется в полустерильном фенотипе: продуцируется как стерильная, так и фертильная пыльца Вероятно, продукт гена Fr избирательно элиминирует те митохондрии, которые содержат pvs–локус

27. Но откуда у ЦМС растений нормальные митохондрии? Скорее всего, в незначительном количестве они сохраняются даже при ЦМС Органеллы, содержащие pvs-локус, у фертильных ревертантов сохраняются в субстохиометрическом количестве – менее одной копии на 100 клеток

28. Модифицирует структуру митохондриального генома ген- восстановитель Rf3S-типа стерильности кукурузы Ген Rf3 кукурузы S2 мтДНК S1 S2 S1 и S2- репликоныв митохондриях исчезают как самостоятельные ДНК-молекулы но в митохондриальном геноме обнаруживаются S -последовательности

29. 2. Эффект генов Rf на экспрессию ЦМС-локусов Присутствие гена Rf1незначительно подавляет транскрипцию мРНК urf13, но изменяет процессинг Т-тип ЦМС кукурузы Rf1 urf13▲ пре-мРНКurf13 мРНКurf13▲ Уменьшено число полных матриц мРНКurf13 основным у растений с Rf1-аллелем становится «укороченный» транскрипт, содержащий неполнуюпоследовательность urf13 количество 13 кД «стерильного» белка снижено Растения кукурузы с Т-типом цитоплазмы и геном Rf1 в ядре, несмотря на уменьшение количества 13 кД белка, остаются мужски стерильными

30. Для восстановления фертильности при Т-типе цитоплазмы необходимо два гена: Rf1 и Rf2 Лишь в присутствии доминантного аллеля второго гена-восстановителя – Rf2восстанавливается нормальный процесс формирования жизнеспособной пыльцы. Ген Rf2 кодирует белок, чрезвычайно сходный с митохондриальной альдегид дегидрогеназой Каков механизм действия гена Rf2, неизвестно.

31. Rf3у кукурузы с ЦМС-S также приводит к появлению более коротких транскриптов митохондриальных генов cob, atp6, orf355, orf77в пыльце восстановленных растений по сравнению со стерильной пыльцой У петунии под действием генов-восстановителей также происходит снижение уровня 25 кД белка, кодируемого S-pcfлокусом

32. Восстановление фертильности у подсолнечника Связано с тканеспецифическим уменьшением количества молекул транскриптовхимерного цистрона atpA-orf522 происходит только в мужских цветках восстановленных растений Механизм действия гена – восстановителя в данном случае – полиаденилирование РНК-матриц, что вызывает их ускоренную деградацию

33. Ген-восстановительBrassica действует тканеспецифически Генизменяет полученный orf224/atp6транскрипт: У стерильных линий обнаруживаются два полноразмерных транскрипта размером 2.2 и 1.9 т.п.н У восстановленных линий появляются более короткие, прошедшие процессинг транскрипты 1.4 и 1.3 т.п.н такие транскрипты обнаруживаются в лепестках, тычинках, плодолистиках, но не в чашелистиках

34. Итак, на стадии транскрипции основные механизмы действия Rf-генов: – укорочение транскриптов (процессинг); - уменьшение числа матриц мРНК(полиаденилирование с ускоренным распадом).

35. 3. Эффект генов Rf на посттрансляционную регуляцию В присутствии генов Rf отмечается снижение количества белка ORF138 у рапса с типом ЦМСogura Эффект сильнее всего выражен в пыльниках на той стадии, на которой обычно экспрессируется стерильный фенотип Транскрипция и трансляция гена orf138 как стерильных, так и восстановленных растений осуществляются с равной эффективностью Rfо ген рапса действует на посттрансляционном уровне, уменьшая стабильность белкаORF138 и восстанавливая фертильность

36. Эффект генов Rf на РНК-редактирование Rf3 ген у рисадействует на процессинг дицистрона: от аtp6 гена отщепляется аномальный3' участок (причина ЦМС), после чего проходит нормальный эдитинг Rf3 ген у соргооблегчает процессинг прошедших эдитинг транскриптов на 75%уменьшается количество длинных транскриптов гена orf107(1110, 870пн), накапливаются короткие 380 пн, которые у стерильных форм были в следовых количествах

37. ( ( У петунии удалось выделить и клонировать ген, который прямо влияет на экспрессию CMS-гена

38. Эффект ядерных генов-восстановителей фертильности может быть двух типов: если ЦМС возникает в результате потери или инактивации какого-то фактора, то ген-восстановитель должен обеспечить растение комплементарно действующим субстратом если ЦМС возникает в результате синтеза новым химерным геном какого-то токсического продукта, ген-восстановитель должен каким-то образом инактивировать этот ген либо его продукт Большинство исследованных к настоящему времени ЦМС-систем и генов-восстановителей представляют пример второго типа

39. Восстановители фертильности разных ЦМС-систем могут: - снижать количество полноразмерных транскриптов ЦМС-генов, влияя на РНК-процессинг и РНК-эдитинг; - изменять число копий митохондриальных хромосом, несущих ЦМС-ген - уменьшать количество продукта ЦМС-генов, действуя посттрансляционно Системы восстановления фертильности, вероятно, не менее разнообразны, чем ЦМС-системы

40. Природа дефектов, возникающих при ЦМС Первые признаки аномального развития пыльников часто, хотя и не всегда, наблюдаются на стадии мейоза материнских клеток пыльцы ??? В клетках тапетума количество митохондрий увеличено в 20-40 раз по сравнению с другими тканями растений тапетум Прямые доказательства критической роли тапетума в развитии пыльцы были получены на трансгенных растениях: Чужеродный рибонуклеазный ген, экспрессирующий токсический продукт под действием специфического для ткани тапетума промотора, вызывал формирование стерильных пыльников

41. Действительно лиorf239-ген фасоли виновен в формировании стерильности пыльцы??? Ген был введен в ядерный геномтабака orf239 Трансформанты, получившие orf239, имели стерильную или полу-стерильную пыльцу При этом их митохондрии не несли никаких мутаций!

42. Растения с Т-типом ЦМС у кукурузы высокочувствительны к токсину, вырабатываемому грибом Helminthosporium maydis к пестициду метомилу Ген urf13ЦМС-T кукурузы была введен в экспрессируемом векторе в E. сoli Трансформированные бактериальные штаммы отличались морфологическими изменениями и/или замедленным ростом и, так же, как ЦМС-T растения, были чувствительны к грибному токсину Если ген urf13 изменялся в результате мутации, все перечисленные эффекты исчезали

43. ТоксинH. maydis связывается с белкомURF13 в митохондриях это приводит к увеличению проницаемости мембран митохондрий и нарушению дыхания

44. В отсутствие токсина растения с Т-цитоплазмой абсолютно не проявляют фенотипической депрессии, лишь развитие пыльцы останавливается Гипотеза: пыльники продуцируют какое-то вещество, которое действует аналогично Т-токсину или метомилу, что и приводит к их аномалии Природа данного вещества и сам факт его существования пока не установлены

45. ЦМС – еще одна загадка эволюционного процесса В ядерном геноме некоторых образцов присутствуют гены, подавляющие весьма тонким образом экспрессию строго определенного локуса чужого митохондриального генома, с которым эти образцы никогда возможно ранее не контактировали эти гены оказываются эффективными уже при первой встрече со стерильной цитоплазмой У некоторых видов растений ЦМС- гены митохондрий имеют гомологичные нуклеотидные последовательности – горизонтальный перенос???

46. Разгадывайте загадки природы