实验十动物病毒培养技术之

实验十动物病毒培养技术之 ----鸡胚接种

一、目的 1、掌握鸡胚接种途径和接种方法。 2、了解新城疫病毒或鸭肝炎病毒在鸡胚（鸭胚）尿囊腔的增值过程，接毒和收毒的方法。

二、原理：病毒缺乏完整的酶系统，不能单独进行物质代谢，必须在活细胞中寄生，由宿主细胞提供病毒合成原料，能量与场所，而且只能在易感的活细胞中才能寄生、繁殖。二、原理：病毒缺乏完整的酶系统，不能单独进行物质代谢，必须在活细胞中寄生，由宿主细胞提供病毒合成原料，能量与场所，而且只能在易感的活细胞中才能寄生、繁殖。

动物病毒培养：可在自然宿主、实验动物、鸡胚或细胞培养中进行，以死亡、发病或病变等作为病毒繁殖的直接指标。动物病毒培养：可在自然宿主、实验动物、鸡胚或细胞培养中进行，以死亡、发病或病变等作为病毒繁殖的直接指标。

鸡胚（或鸭胚）培养法：是为病毒和立克次氏体常用的活细胞培养方法之一，此方法可用于某些病毒的分离、增殖、毒力滴定、中和试验及生产疫苗等。操作简便，来源易，本身少带病毒等特点。鸡胚（或鸭胚）培养法：是为病毒和立克次氏体常用的活细胞培养方法之一，此方法可用于某些病毒的分离、增殖、毒力滴定、中和试验及生产疫苗等。操作简便，来源易，本身少带病毒等特点。

鸡新城疫病毒（NDV）属于副粘病毒科，对外界抵抗力较强。实验室检验时病毒分离可用鸡胚进行。鸭病毒性肝炎病毒（DHV）细胞培养困难，国际通用的检疫手段和诊断方法仍然是鸡（鸭）胚中和试验。鸡新城疫病毒（NDV）属于副粘病毒科，对外界抵抗力较强。实验室检验时病毒分离可用鸡胚进行。鸭病毒性肝炎病毒（DHV）细胞培养困难，国际通用的检疫手段和诊断方法仍然是鸡（鸭）胚中和试验。

三、鸡胚的结构和生长过程

鸡蛋的结构

受精蛋

孵育周期

鸡（鸭）胚结构

壳内的尿囊膜、血管、胚体 不同日龄鸡胚状况丰富的血管幼小的胚体

四、鸡（鸭）胚培养法准备 1、器具： • 孵卵箱、检蛋灯（照蛋器）、蛋盘 • 镊子、碘酊、注射器、针头、三棱针、眼科剪、眼科镊、固体石蜡、酒精灯、无菌室。 • 病毒液、双抗

2、鸡卵的选择与孵育： • 选卵：通常选用来亨鸡卵，因卵壳薄和色白，易于观察胚胎的生活情况。清水洗净受精卵卵壳，拭干，放入孵化箱，38-39℃相对湿度45-60%，孵育3日后鸡卵每日翻动1-2次。 • 检卵（胚）：受精卵，4天后可见清晰的血管小团，其中有鸡胚暗影。未受精卵，4天后仅见卵黄黑影，可剔除。死亡胚或濒死期胚，鸡胚活动呆滞或不动，血管昏暗或模糊不清，应及时淘汰。

3、鸡胚（鸭）接种： • 接种途径： • 卵黄囊接种 • 羊膜腔接种 • 绒毛尿囊腔接种 • 绒毛尿囊膜接种

常见病毒用鸡胚培养的接种途径 注：++++ +++ ++ +，表示鸡胚组织对病毒敏感性的强弱

4、收获 • 24h后死亡胚取出，最好置4℃冰箱中冷却4小时，以免收获时出血。 • 用碘酊消毒气室端，然后用镊子击破气室端卵壳（胚壳），沿气室周围剪除胚壳，撕去壳膜，无菌撕开尿囊膜。 • 用无菌玻璃吸管吸取尿液和羊水，置无菌瓶中，备做血凝实验或其他实验用

实验安排 • 每人一枚鸡胚或鸭胚，只有其一。接种尿囊腔。 • 每组一个照蛋器，轮流照蛋，画出气室，选定接种部位，标记好自己的名字。 • 每班放置在统一的蛋盘里，进行孵育。 • 每班按时观察胚的生长和死亡情况，按要求收获尿液和羊水。

【绒毛尿囊腔接种】 1、9-10日龄鸡胚，照蛋以铅笔划出气室、胚胎的位置。 2、用碘酊在接种处的蛋壳上消毒，酒精棉脱碘，用三棱锥在酒精灯火焰烧灼消毒后，并在标记处打孔。 3、注射针头从小孔处插入0.5cm，注射量0.1-0.2mL。 4、注射后以石蜡封闭小孔，置孵育箱中直立孵育。

【接种后检查】 接种后24h内死亡的鸡胚，系由于接种时鸡胚受损或其他原因死亡，应该弃去。 24h后，每天照蛋2次，如发现鸡胚死亡立即放人冰箱，于一定时间内不能致死的鸡胚亦放入冰箱冻死（标记）。死亡的鸡胚置冰箱中4h即可取出收获尿液和检查胚胎病变。

鸡胚接种程序图 照蛋胚、气室标记胚壳消毒（碘酒、酒精）打孔接种种毒白蜡封口孵育 end

卵黄囊接种

羊膜腔接种

尿囊腔接种1

尿囊腔接种2

绒毛尿囊膜接种

初发育的受精卵

请同学们上前 看老师示范操作

实验十 动物病毒培养技术之