СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК

1. СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК Невяна Иванова, доктор РумянаДодова, магистър Даниела Дачева, магистър Център по Молекулна Медицина Медицински Университет - София

2. СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК • Секвениране генома на РНК-съдържащия бактериофаг MS2 (Fiers et al 1976) • Секвениранегеноманафага Х174 (~5kb) поплюс/минусметода (Snager&Coulson, 1977) • Първи метод за секвениране на ДНК: Секвениране чрез „химично накъсване“, ~500 нтд (Maxam & Gilbert, 1977) • Секвениране чрез „верижно терминиране на синтеза на ДНК“, (Sanger et al, 1977) Oпределяне последователността на свързване на четирите основни нуклеотидни базиG,А,C,Т,в първичната структура на ДНК.

3. Thermal cycle sequencing • Автоматично секвениране - Верижно терминиране с флуоресцентно-белязани дидезоксинуклеотиди (Dye-terminator sequencing); • - Капилярна електрофореза; • - Лазерна детекция на сигнала. HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING • Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS) • Polony sequencing (eмулсионен PCR) • Pyrosequencing • Solexa sequencing (bridge PCR, reversible dye terminator) • Sequencing by ligation (SOLiD) • Ion-semiconductor sequencing • Nanoball sequencing • Single-molecular sequencing (Helioscope) • Single-molecule Real-Time sequencing • Nanopore • VisiGen (FRET, полимераза с флуоресцентен донор в АЦ) • Секвениране чрез хибридизация (Microarray)

4. НЕДОСТАТЪЦИ: • Изисква голямо количество ДНК • Токсичност на реактивите • Невъзможна автоматизация • Къси секвенции • Затруднено отчитане • ПРИЛОЖЕНИЕ: • ДНК-Белтъчни взаимодействия • Вторична структура на ДНК • Локализиране на редки бази • Епигенетични модификации CH3 Метод на Маxam-Gilbert • Allan Maxam & Walter Gilbert, 1977г. • Gilbert, Sanger, Berg,Нобелова награда, 1980, за: Д“принос към определянето на базовите секвенции в НК”Директно секвениране, чрез химично модифициране на базите в ДНК-молекулата и последващо базово-специфично накъсване, без да е необходимо предварително клониране

5. Секвениране по Sanger Frederick Sanger, 1974, Нобелова награда, 1980 Секвениране чрез случайно терминиране на синтеза, с радиоактивно-белязани ддНТФи • ДНК, Праймер, Буфер, дНТФ • ддНТФ • 5´- белязване с 32Р • Т7 ДНК-полимераза, topt (37°С) • четири отделни реакции • всеки етап - в отделен термоблок

6. THERMAL CYCLE SEQUENCING ( Sears et al., 1992) • Откриване на термостабилна ДНК-полимеразаи PCR • Методът използва dsDNA и много по-малко количество матрица (не е необходимо предварително клониране на фрагмента). • Процесът е като PCR, но само с един праймер и всяка реакционна смес съдържа по един терминиращ ddNTP. За разлика от PCR, нарастването на продукта е линейно, а не експоненциално, тъй като се копира само едната верига. Както при класическия метод на Sanger, наличието на ddNTP в реакционната смес води до верижно терминиране. Получените вериги с различна дължина, се разделят електрофоретично и могат да се прочетат.

7. АВТОМАТИЧНО СЕКВЕНИРАНЕ (Leroy Hood and colleagues,1986) Метод за секвениране на ДНК, при който радиоактивно-белязаните нуклеотиди и директното прочитане, са заменени с флуоресцентно белязване, лазерно-индуцирана детекция на сигнала и компютъризирано четене на секвенцията. Използвани са флуоресцентно-белязани праймери. Приготвят се 4 отделни реакции – по една за всеки ддНТФ, във всяка, от които праймерът е белязан с различен флуорохром. Флуоресцентното белязване прави възможно автоматичното прочитане на секвенцията с помощта на компютърна програма. Въвеждането на автоматичното секвениране с флуоресцентно-белязани ддНТФ направи възможно постигането на висока ефективност при секвениране.

8. АВТОМАТИЧНО СЕКВЕНИРАНЕ Секвениране сфлуоресцентно- белязани праймери Секвениране с флуоресцентно-белязани ддНТФ • ПРЕДИМСТВА • без “labeling step” • Thermal cycle – sequencing • PCR - апарат • Надежден, лесноизпълним и ефективен протокол • Високата температура намалява вторичните структури, висока специфичност при праймиране, анилинг, удължаване • Един протокол за секвениране на ss и dsDNA • Възможност за секвениране на “трудни матрици” (BAC)

9. АВТОМАТИЧНО СЕКВЕНИРАНЕ С ФЛУОРЕСЦЕНТНО-БЕЛЯЗАНИ ддНТФи Р1. Реакциите за четирите ддНТФ се извършват в една епруветка, като всеки ддНТФ е белязан с различен флуорофор. П2. При придвижването си в гела, всеки фрагмент преминава през детектор, който идентифицира терминиращия ддНТФ, присъстващ всъответния фрагмент по сигнала от флуорофора. И3. Информацията от сигнала се преобразува и визуализира като серия от пикове с различен цвят GATCи позиция. Смес от флуоресцентно-белязани ддНТФи Система за визуализация Детектор Флуоресцентно-белязаните фрагменти преминават през детектора по нарастване на молекулната маса

10. ВЕРИЖНО ТЕРМИНИРАНЕ С ФЛУОРЕСЦЕНТНО-БЕЛЯЗАНИ ддНТФи Rhodamine DyeTerminators Rhodamine Fluorescein DNA-Rhodamine-Fluorescein

11. АВТОМАТИЧЕН СЕКВЕНАТОР АВІ3130хl

12. СИСТЕМЕН ХОДНАСЕКВЕНИРАНЕ • ИЗБОР НА СТРАТЕГИЯ • Дължина на матрицата • Хомогенност на пробата • Брой проби • Информация за региона

13. СеквениранеDe novo • МЕТОДИ • Shot-gun • Primer walking • Случайно праймиране с транспозони • Nested - делеции • Секвениране на мРНК • PCR-амплификация

14. RESEQUENCING • PCR – праймери • Праймери с “опашка” за секвениране • Nested(вътрешен) праймери ЕПИГЕНЕТИКА След третиране с натриев бисулфит MLST (Multi Locus Sequence Typing)

15. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧНО ОПРЕДЕЛЯНЕ • Измерване на УВ-абсорбциятаПурини и пиримидини – 260 nm • CssDNA= A260 x 33 μg/μl • CdsDNA= A260 x 50 μg/μl АГАРОЗНА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА Mass Ladder Смес от молекулни маркерис известна дължина (кб) и тегло (ng) ОЦЕНКА НА ИЗОЛИРАНАТА ДНК Капилярна електрофореза Анализ на данните Секвенционна реакция Изолиране на НК PCR Пречистване Преутаяване • Чистота на ДНК • А260/A280: 1.7 - 2.0 • < 1.7 остатъчни белтък/фенол • > 2.0 остатъчна РНК • А230/A260: 0.3 – 0.9 • > 0.9 остатъчни захари

16. ОЦЕНКА НА ИЗОЛИРАНАТА НК • ABSOLUTE QUANTITATION • Измерва общото количество на амплифициращата се ДНК • Изисква изготвяне на стандартна крива с помощта на геномна ДНК с известна концентрация, предварително измерена спектрофотометрично • TaqMan® анализ – изключително точно измерване • SYBR®Green анализ (MGB) – по-ниско специфичен • Багрилото се свързва с всяка dsDNA ФЛУОРИМЕТРИЧЕН АНАЛИЗ Интеркалиращи бои Hoechst #33258Нисък афинитет към РНК свързва се преференциално към АТ-участъци Етидиев бромид Свързва РНК, състава на ДНК не е от значение Детектира много ниски количества ДНК Висока чистота при ДНК с високо GC-съдържание PicoGreenДетектира количества < 25 pg/ml, до 100 ng/ml

17. ДИЗАЙН НА PCR-ПРАЙМЕРИ Стандартен PCR Бисулфит-специфичен PCR • 18 – 24 олигонуклеотид18-мер за GC-богати участъци • 50°C < Тm < 65°C Tm = (A+T) x 2°C + (G+C) x 4°C • Eквимоларно съдържание на нтд бази: (A+T) / (G+C) - до 60/40 • отсъствие на комплементарни участъци(праймер-димери) • отсъствие на вторични структури (hairpin formation) • отсъствие на вторично-свързващи места • дължина > 30 нуклеотида • Tm ~ 60°C • да се избягват СрG в праймераТА-богати праймери • формиране на праймер – димериКонцентрация < 3 pmol • mismatch hybridization ↗ Тm - добавяне на 5´-край за секвениране с универсални праймери 21М13 (Forward) 5´TGTAAAACGACGGCCAGT3´ M13rev (Reverse) 5´CAGGAAACAGCTATGACC3´

18. PCR ЗА СЕКВЕНИРАНЕВисока специфичност и чувствителност Капилярна електрофореза Анализ на данните Изолиране на НК Секвенционна реакция PCR Пречистване Преутаяване Оптимизиран master-mix • дизайн на праймери • концентрация на MgCl2 • концентрация на dNTP • праймерна концентрация • концентрация на ДНК • параметри на PCR • ензим Taq-полимераза„hot-start“- метод

19. PCR - СИСТЕМИ • Секвенции ~ 600 н.дв., 40 мин. – Бърза амплификация • Амплификация на тандемно-повторени последователности • Taq-полимераза с proofreading-активност (< 10 kб) • - за амплификация на микросателитни маркери • Амплификация на GC-богати участъци • Hot-start– полимераза за ДНК-участъци, съдържащи GC> 65%; • Саксесорни протеини за повишаване на специфичността. • Секвениране на дълги участъци (long range) • < 15 kб - Hot-start+ Proofreading (запазена 3’-5’екзонуклеазна активност), висока точност при клониране и мутагенеза • < 20 kб Антитяло медииран Hot-start+ аксесорни протеини за повишаване на специфичносттта;

20. КОЛИЧЕСТВО И КАЧЕСТВО НАДНК-МАТРИЦАТА ЗА СЕКВЕНИРАНЕ Капилярна електрофореза Анализ на данните Секвенционна реакция Изолиране на НК PCR Пречистване Преутаяване n (брой бази в таргетната секвенция) 50 Количество ДНК-матрица (ng) = • Наличие на протеини, детергенти, геномна ДНК • Намаляват живота на капилярата • Късен старт на секвенцията • Непречистена матрица или наличие на множество матрици • Дължината на четене намалява • Намаляват живота на капилярата • Лошо качество на данните • Наличие на соли и ЕДТА-съдържащи буфери • Инжектират се преференциално • Инхибират ДНК-полимеразната активност • Лошо качество на данните

21. ПРЕЧИСТВАНЕ НА PCR-ПРОДУКТАПремахване на остатъка от реакционните компоненти Колонен Ензимен Гел-екстракция Разреждане МЕТОДИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ Eкзонуклеаза I (ЕхоI)- разгражда едноверижна ДНК (праймери) Алкална фосфатаза (SAP/CIP) -дефосфорилира дНТФ • гел-филтрация • ултрафилтрация PCR-продукт/ дест. вода (1/5 или 1/10)

22. ИЗБОР НА МЕТОД ЗА ПРЕЧИСТВАНЕЗависи от качеството на PCR-продукта

23. ИЗБОР НА СЕКВЕНЦИОННИ ПРАЙМЕРИ

24. THERMAL CYCLE SEQUENCING Капилярна електрофореза Анализ на данните Секвенционна реакция Изолиране на НК PCR Пречистване Преутаяване • ДНК-матрица • Праймер • BigDye®Terminator • Буфер • AmpliTaq®DNAPol FS • ниска дискриминация между дНТФ и ддНТФ; • почти липсваща 5´-3´-eкзонуклеазна активност; • комбиниран с термостабилна неорганична пирофосфатаза.

25. BigDye®Terminator Sequence Kits

26. Секвениране на GT-богат районс BigDye®Terminatorv3.1/1.1 Секвениране на GT-богат районс dGTPBigDye®Terminatorv1.0/3.0 Секвениране на 2 хомополимерни Т-участъка сdRhodamine®Terminator

27. МЕТОДИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ НА СЕКВЕНЦИОННИЯ ПРОДУКТ Мембранно филтриране Гел-филтрация BigDye®XTerminator Магнитни частици Етанолна преципитация ПРЕЧИСТВАНЕ НА СЕКВЕНЦИОННИЯ ПРОДУКТ Капилярна електрофореза Анализ на данните Секвенционна реакция Изолиране на НК Остатъчните небелязани и флуоресцентно – белязани компоненти на реакцията възпрепятстват електрокинетичното инжектиране на пробата, електрофоретичното разделяне и анализа на данни. PCR Пречистване Преутаяване „dye blobs“

28. EDTA/CH3OONa/ЕТАНОЛНА ПРЕЦИПИТАЦИЯ • Преутаяване на секвенционния продукт с абсолютен етанол • EDTA – стабилизира секвенционния • Натриев ацетат – запазва късите секвенционни продукти • Лесен и евтин • Възпроизводим • Работа с всички формати • Относително дълга процедура • Центрофуга с носачи за плаки • Риск от загуба на утайката Провежда се при стайна температура Абсолютен етанол – 96% Използва се прясно приготвен етанол 3 М Натриев ацетат (pH 4.8) Отстраняване на етанолните остатъци след последното центрофугиране

29. Смес от LMW и HMW - молекули ГЕЛ-ФИЛТРАЦИЯ Филтрираща смола • Колона Sephadex G-50 • пореста смола „молекулно сито“ • секвенционната реакция се нанася в центъра на колоната • „задържа“ LMW-молекули и пропуска HMW-молекули LMW се абсорбират и елуират последни HMW преминават свободно и се елуират първи • Лесен • Възпроизводим • Подлежи на автоматизация • Относително скъп • Допълнителна обработка с • SDS и нагряване (BDТv3.1) УЛТРАФИЛТРАЦИЯ Отстраняване на замърсяванията чрез филтриране на секвенционния продукт през финна мембрана с размер на порите 0.1 – 10 μm

30. ПРЕЧИСТВАНЕ С МАГНИТНИ ЧАСТИЦИ Магнитно разделяне и отстраняване на надутайката Ресуспендирани магнитни частици 1. Отмиване 2. Елуиране на таргета с ниско-солеви буфери или дестилирана вода 3. Отстраняване на магнитните частици в магнитно поле Свързване на лиганда с магнитните частици • Лесен и ефективен • Високо специфичен • Възможност за роботизация • Относително скъп • Изисква биотинилиран праймер • Изисква специална апаратура • Афинитетна хроматография с магнитно разделяне • магнитни частици, с имобилизиран лиганд (целулоза, оligo (dT), стрептавидин и др.), с афинитет към НК • лигандът свързва секвенционният продукт, а дНТФи, праймери и соли остават в разтвора Добавяне на смес с таргетната молекула Лиганд Афинитетно свързване

31. ПРЕЧИСТЕН СЕКВЕНЦИОНЕН ПРОДУКТ ЕЛЕКТРОКИНЕТИЧНА ИНЖЕКЦИЯ Не е необходима топлинна денатурация преди инжектирането ПОДГОТОВКА НА ПРОБАТА ЗА ИНЖЕКТИРАНЕ Капилярна електрофореза Анализ на данните Секвенционна реакция Изолиране на НК PCR Пречистване Преутаяване УТАЙКА ЕЛУАТ/ФИЛТРАТ BigDye®XTerminator™ Ресуспендиране в HI-DI™формамид

32. ПОДГОТОВКА НА ИНСТРУМЕНТАКОНСУМАТИВИ ABI3730xlСеквенционни стандартиПолимер РОР™КапиляриБуфер за електрофорезаКАЛИБРАЦИЯ НА ИНСТРУМЕНТАПространственаСпектралнаData Collection softwareСЪЗДАВАНЕ НА ФАЙЛ С ВХОДЯЩИТЕ ПРОБИДЕФИНИРАНЕ НА ГРУПИС РЕЗУЛТАТИИЗБОР НА ПРОТОКОЛInstrument protocolAnalysis protocolПОСТАВЯНЕ НА ПРОБИТЕ В АПАРАТАСТАРТИРАНЕ НА ИНСТРУМЕНТА

33. АНАЛИЗ НА ДАННИТЕ Капилярна електрофореза Анализ на данните Секвенционна реакция Изолиране на НК PCR Пречистване Преутаяване