S.I.Mi.S.A .

1. S.I.Mi.S.A. Stato avanzamento lavori SAL I – II - III

2. Il Progetto S.I.Mi.S.A. “Strumenti Innovativi per il Miglioramento della Sicurezza Alimentare” BUDGET Ricerca Industriale: 5.901.965 € Sviluppo Sperimentale:1.337.462 € Formazione: 1.037.175 € Responsabile scientifico: Dott. Angelo Visconti

3. Obiettivo Generale L’obiettivo generale del progetto è la messa a punto di strumenti innovativi e affidabili per intervenire a livello di: PREVENZIONE – CONTROLLO – CORREZIONE della contaminazione al fine di contribuire alla realizzazione di un sistema integrato di sicurezza lungo tutta la filiera. Keyfoods pugliesi: uva e vino, frumento e altri cereali e derivati, ed un insieme di prodotti freschi quali molluschi bivalvi, carni bovine, mozzarella e prodotti ortofrutticoli. • Selezionati in base a: • rischio di contaminazione da differenti classi di contaminanti, • valenza economica e territoriale, • livello di interesse scientifico in termini di applicazione di tecnologie innovative.

4. Problematiche Tecnico-scientifiche Filiera viti-vinicola Filiera CEREALICOLA PRODOTTI FRESCHI • Ocratossina A • Fitofarmaci • Allergeni • Brettanomyces • bruxellensis • Micotossine • Fitofarmaci • Funghi tossigeni • Bacilli • Insetti • Metalli pesanti • Pseudomonasspp. • Patogeni emergenti • Listeria • Salmonella Limiti imposti dalle normative – Esigenze reali delle imprese RISULTATI ATTESI: Metodi rapidi e avanzati per la rivelazione di contaminanti chimici. Nuovi metodi per il rilevamento di microrganismi patogeni e alteranti. Acquisizione di nuove conoscenze Trasferimento tecnologico – Scale up industriale

5. Struttura del Progetto di Ricerca

6. % Avanzamento Rendicontazione per OR SAL I - II - III

7. % Avanzamento Rendicontazione per OS SAL I - II - III

8. Attività preliminari

9. Avanzamento OS 2.1/ OS 4.1

10. Avanzamento OS 6.1//7.2

11. OR 1 – Strumenti Preventivi Innovativi per la Riduzione del Rischio di Microrganismi Alteranti in Vino OS 1.1: Messa a punto di un protocollo biotecnologico per minimizzare lo sviluppo di lieviti del genere Brettanomyces e per ridurre la produzione e la presenza di etilfenoli nel vino Partner: • Università degli Studi di Foggia - Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell’Ambiente (SAFE) • ISPA-CNR (Lecce) Soggetto attuatore: • D.A.Re. scrl

12. Avanzamento OS 1.1

13. Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013) • Task 1.1.1: Sviluppo di metodiche biotecnologiche e cromatografiche per l'analisi delle dinamiche microbiche di Brettanomycesbruxellensis (M1-12) - stato: completato • Task 1.1.2: Studio dell’influenza dei parametri fisico-chimici relativi alle vinificazioni aziendali sullo sviluppo di diversi ceppi di Brettanomyces bruxellensis isolati da vini pugliesi e sulla connessa produzione di etil-derivati (M5-25) - stato: in corso (50% completamento) • Task 1.1.3: Studio di strategie di riduzione del rischio da Brettanomyces bruxellensis e definizione di un protocollo di prevenzione (M9-27) - stato: in corso (35% completamento)

14. Risultati Principali – Task 1.1.1 (UNIFG, CNR) • Task 1.1.1: Sviluppo di metodiche biotecnologiche e cromatografiche per l'analisi delle dinamiche microbiche di Brettanomycesbruxellensis • Selezione di ceppi di Brettanomyces bruxellensis in vini pugliesi e validazione della metodica molecolare per l’identificazione e quantificazione rapida di B. bruxellensis in vino • Ottimizzazione di un metodo basato sull’applicazione dell’ HPLC per la quantificazione degli acidi idrossicinnamicie dei corrispondenti vinil- ed etil-derivati in vino

15. Risultati Principali – Task 1.1.2 (UNIFG, CNR) • Task 1.1.2: Studio dell’influenza dei parametri fisico-chimici relativi alle vinificazioni aziendali sullo sviluppo di diversi ceppi di Brettanomycesbruxellensis isolati da vini pugliesi e sulla connessa produzione di etil-derivati • Studio sulla relazione tra sviluppo di B. bruxellensis, produzione di etilderivati, e diversi parametri chimico-fisici specifici delle vinificazioni svolte presso le aziende proponenti • Analisi del trascrittoma di un ceppo di B. bruxellensisaccresciuto in mosto-vino

16. Risultati Principali – Task 1.1.3 (UNIFG, CNR) • Task 1.1.3: Studio di strategie di riduzione del rischio da Brettanomycesbruxellensis e definizione di un protocollo di prevenzione • Protocollo di gestione delle risorse microbiche per la riduzione di B. bruxellensis e di fenoli volatili (etil-derivati) da esso prodotti. • Protocollo di utilizzo delle scorze cellulari di lieviti per la riduzione dei fenoli volatili (etilderivati) prodotti da B. bruxellensisin vino.

17. OR 2 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Uva e Vino • OS 2.2: Messa a punto di una metodica multi-analita LC-MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni nel vino Partner: • ISPA-CNR (Bari) Soggetto attuatore: • D.A.Re. scrl

18. Avanzamento OS 2.2

19. Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013) • Task 2.2.1: Messa a punto di una metodica multi-analita LC-MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni in vini chiarificati (M1-36) • - stato: in corso (60% di completamento) • Task 2.2.2: Sviluppo di un immunosaggio basato su SPR per la determinazione di allergeni di latte e uova in vini chiarificati (M7-36) • - stato: in corso (20% di avanzamento)

20. Risultati Principali - Task 2.2.1 (ISPA-CNR) • Task 2.2.1: Messa a punto di una metodica multi-analita LC-MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni in vini chiarificati Attività 2.2.1.a - Sviluppata con successo una metodica sensibile e affidabile per la simultanea estrazione e purificazione di allergeni di latte e uovo in vini bianchi chiarificati con caseinati (chiarificante A) e bianco d’uovo (chiarificante B) Attività 2.2.1.b - Ottimizzate le condizioni di separazione ed analisi dei peptidi derivanti dall’idrolisi enzimatica della componente allergenica tramite HPLC-spettrometria di massa ad alta risoluzione Attività 2.2.1c - Almeno due proteine allergeniche rivelate (alfa caseina e beta caseina per agente A; ovalbumina e lisozima per agente B) ed almeno due peptidi identificati per ciascun allergene in campioni di vino chiarificato. Limiti di rivelabilità raggiunti con il metodo HPLC-MS/MS sviluppato: < 1 µg/mL Monaci et al, Multiallergenquintification of fining-relatedegg and milkproteins in whitewines by high-resolution-mass-spectrometry. RapidCommun. Mass. Spec. 2013,27,2009-18. Trattamento bioinformatico Pretrattamento Vino chiarificato Allergene Idrolisi enzimatica Analisi HPLC-HRMS

21. Risultati Principali- Task 2.2.2 (ISPA-CNR) • Task 2.2.2: Sviluppo di un immunosaggio basato su SPR per la determinazione di allergeni di latte e uova in vini chiarificati • Valutazione di chip diversamente modificati e di diverse tipologie di anticorpi (mono e policlonali) mirati alla messa a punto di un immunosensore SPR per la rivelazione di allergeni di uovo • Ottimizzazione delle condizioni d’immobilizzazione (pH, forza ionica) dell’anticorpo biotinilato prescelto per la sua immobilizzazione indiretta su biochip di oro modificati con streptavidina. Immunosensore SPR

22. OR 2 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Uva e Vino OS 2.3: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in uva e vino e produzione di materiali di riferimento OS 5.1: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in cereali, produzione di miscele standard e materiali di riferimento Partner: • Lab. Instruments srl • ISPA-CNR (Bari) Soggetto attuatore: • D.A.Re. scrl • LE ATTIVITA’ DELL’OS 2.3 SONO SVOLTE CONGIUNTAMENTE A QUELLE DELL’OS 5.1

23. OR 3 – Strumenti Correttivi Innovativi per la Rimozione di Metaboliti Microbici Indesiderati nel Vino OS 3.1: Messa a punto di un prototipo per la rimozione dell’ocratossina A (OTA) nel vino mediante la tecnica del ripasso continuo su vinacce/buccette Partner: • ISPA-CNR (Bari) • Industrie Fracchiolla srl Soggetto attuatore: • D.A.Re. scrl

24. Avanzamento OS 3.1

25. Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013) • Task 3.1.1 – Reperimento di vinacce esenti da OTA e di partite di mosti/vini naturalmente contaminati da OTA - stato: in corso (10% completamento) • Task 3.1.2 – Stabilizzazione delle vinacce - stato: in corso (20% completamento) • Task 3.1.4 – Sviluppo di un prototipo per il ripasso in continuo su vinacce e/o loro componenti - stato: in corso (20% completamento)

26. Risultati Principali • Task 3.1.1: Reperimento di vinacce esenti da OTA e di partite di mosti/vini naturalmente contaminati da OTA • Task 3.1.2: Stabilizzazione delle vinacce • Task 3.1.4: Sviluppo di un prototipo per il ripasso in continuo su vinacce • Le vinacce (cv amarone) sono state reperite presso il centro di ricerca per la viticoltura di Conegliano (CRA). • È stata stimata la carica microbica batterica e fungina iniziale mediante conta in piastra: 3,2·105 UFC/g (concentrazione batterica) 2,2·106UFC/g (concentrazione fungina) • È stato valutato l’effetto delle diverse condizioni di stabilizzazione (°C, SO2, tempo) sulla carica batterica e fungina • È stata misurata la concentrazione di OTA: 3,1 ± 0,2 µg/kg OTA • È stato ideato (ISPA, Ind. Fracchiolla e consulente enologo) e realizzato (Ind. Fracchiolla) il primo prototipo per le prove di ripasso

27. Risultati Principali – Task 3.1.2 (ISPA-CNR) Popolazionebattericapresente nelle vinacce conservate a differenti temperature ed in presenza o assenza di SO2

28. Risultati Principali – Task 3.1.2 (ISPA-CNR) Popolazione fungina nelle vinacce conservate a differenti temperature ed in presenza o assenza di SO2

29. Risultati Principali – Task 3.1.4 (Industrie Fracchiolla, ISPA-CNR) • Sono stati condotti incontri di lavoro tra personale dell’ISPA-CNR, dell’Industrie Fracchiolla e dell’enologo coinvolto nell’attività progettuale per l’ideazione, la progettazione e la realizzazione di un miniprototipo da laboratorio per le prove di ottimizzazione delle condizioni e modalità di ripasso di vino contaminato da OTA su vinacce incontaminate

30. OR 3 – Strumenti Correttivi Innovativi per la Rimozione di Metaboliti Microbici Indesiderati nel Vino OS 3.2: Sviluppo di metodologie bio-molecolari per la decontaminazione/degradazione dell’ocratossina A (OTA) nei mosti-vini Partner: • ISPA-CNR (Bari) • ISPA-CNR (Lecce) • IBBE-CNR Soggetto attuatore: • D.A.Re. scrl

31. Avanzamento OS 3.2

32. Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013) • Task 3.2.1: Isolamento e caratterizzazione di popolazioni microbiche in grado di degradare l'OTA (M1-24) • stato: in corso (65 % completamento) • Task 3.2.2: Identificazione di geni codificanti gli enzimi correlati alla degradazione di OTA in isolati microbici naturali (M7-34) • stato: in corso(40 % completamento)

33. Risultati Principali - Task 3.2.1 (ISPA CNR) • Attività 3.2.1.a - Individuazione dei campi e campionamento Sono stati individuati 4 vigneti rappresentativi dell’areale di coltivazione delle varietà Negroamaro e Primitivo. Sono stati effettuati campionamenti di terreno, tralci e grappoli. • Attività 3.2.1.b - Analisi chimica E’ statamessa a puntounametodicaanalitica per la determinazionesimultanea di OTA e OTalphanei diversi substrati liquidi mediante HPLC/FLD. • Attività 3.2.1.c - Analisi microbiologica Due fermentazioni spontanee, effettuate utilizzando le uve Negroamaro e Primitivo sono state campionate durante 5 fasi del processo. E’ stata studiata la dinamica di popolazione di lieviti in vinificazione spontanee. Sono stati isolati e identificati 35 ceppi di lievito per ciascuna delle 5 fasi E’ stata indagata la capacità di degradare OTA da parte di 96 ceppi di batteri malolattici.

34. Risultati Principali - Task 3.2.2 (ISPA CNR, IBBE CNR) • Attività 3.2.2.a - Messa a punto di metodiche estrazione di DNA e RNA dai campioni di mosto Il metodo di estrazione di DNA messo a punto consente, partendo da matrici complesse derivate dalla filiera vitivinicola, di ottenere materiale genetico appartenente a microrganismi anche molto distanti dal punto di vista tassonomico (procarioti ed eucarioti). CAMPIONE Estrazione del DNA appartenente all’intera comunità microbica Screening di particolari marcatori genetici di specie che sono selettivamente sequenziati Il metodo sviluppato prevede l’associazione di un kit commerciale di estrazione del DNA da suolo (FAST DNA kit for soil della DBA Italia) con una serie di trattamenti sviluppati per eliminare le impurità e, quindi, aumentare la resa di estrazione e successiva amplificazione di marcatori genetici per la creazione di librerie di sequenziamento NGS. Sequenziamentosuvastascaladell’interometagenoma o metatrascrittoma Caratterizzazione bioinformatica della complessità genetica e tassonomica della comunità microbica

35. Risultati Principali - Task 3.2.2 (ISPA CNR, IBBE CNR) • Attività 3.2.2.a - Messa a punto di metodiche estrazione di DNA e RNA dai campioni di mosto : RISULTATI Acqua di lavaggio dei grappoli Estrazione del metagenoma Mosto ad inizio fermentazione 1500 bp 1000 250 Acqua di lavaggio dei grappoli Mosto

36. Amplificazione del marcatore tassonomico fungino: rDNAITS1-5.8S-ITS2 its1 5.8S rDNA 18S rDNA ITS1 ITS2 its4 28S rDNA M 11 Dimensione attesa dell’amplicone PrimersITS1/ITS4: 5’-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3’/5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ Cavalieri, D. et al (2003). J. Mol. Evol., 57, S226–S232. 400-900 pb (variabile in relazione alla specie) 1500 bo 1000 750 500 250 Amplificazione del marcatore tassonomico batterico: Gene codificante per l’rRNA 16S M 11 16Sr 16Sd Dimensione attesa dell’amplicone Primers 16Sd/16Sr: 5’-GCTGGCGGCATGCTTAACACAT-3’/5’-GGAGGTGATCCAGCCGCAGGT-3’ Ruiz, A. et al (2000 Int. J. Syst. Evol. Micr., 50, 1981-1987. 1500 pb

37. OR 5 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Cereali e Derivati OS 2.3: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in uva e vino e produzione di materiali di riferimento OS 5.1: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in cereali, produzione di miscele standard e materiali di riferimento Partner: • Lab. Instruments srl • ISPA-CNR (Bari) Soggetto attuatore: • D.A.Re.scrl

38. Avanzamento OS 2.3

39. Avanzamento OS 5.1

40. Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013) • Task 2.3.1 - Studio di fattibilità, sviluppo di materiali di riferimento (RM) e loro certificabilità per l’analisi multi residuale di fitofarmaci nella matrice vino mediante strumenti di controllo innovativi (M1-36) • stato: in corso (50% completamento) • Task 2.3.2 - Sviluppo e validazione di metodiche multiresiduali in alta risoluzione (LC-HRMS) per la determinazione di fitofarmaci untargeted nel vino (M7-36) • stato: in corso (20% completamento)

41. Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013) • Task 5.1.1: Individuazione delle sottoclassi di fitofarmaci, studio dell’effetto matrice (frumento) sull’analisi strumentale di fitofarmaci, di solubilità, stabilità ed allestimento delle aliquote da destinare al proficiency test (M1-30) • stato: in corso (50% completamento) • Task 5.1.2: Sviluppo e confronto di metodiche di rivelazione basate sull’uso di spettrometri di massa ad alta risoluzione (untargetedanalysis) e spettrometri a triplo quadrupolo (targetedanalysis) (M7-36) • stato: in corso (20% completamento)

42. Risultati Principali – Task 2.3.1 e 5.1.1 (Lab.Instruments) • Task 2.3.1 e Task 5.1.1: studio di fattibilità e sviluppo di materiali di riferimento • Materiali di riferimento in soluzione standard • Approvvigionamento • Allestimento di soluzioni di singoli fitofarmaci e caratterizzazione delle caratteristiche chimico-fisiche e redazione di “schede prodotto” (circa 220) • Individuazione di sottoclassi da raggruppare in miscele • Allestimento di miscele • Avviamento dell studio di stabilità delle miscele

43. Risultati Principali - Task 2.3.2 e 5.1.2 (Lab.Instruments) • Task 2.3.2 e Task 5.1.2: studio di fattibilità e sviluppo di materiali di riferimento • Materiali di riferimento in matrice • Raccolta di informazioni in merito all’utilizzo cultivar-specifico di fitofarmaci • Screening e caratterizzazione delle matrici “bianche” per l’allestimento di materiali di riferimento • Da un set di 20 campioni di VINO BIANCO (circa 2 L per campione) raccolti da produttori privati sono stati selezionati 8 campioni con tenore di fitofarmaci inferiore al limite di rivelabilità • E’ un corso la caratterizzazione di un set di 20 campioni di FRUMENTO (duro e tenero) provenienti dal mercato locale

44. Risultati Principali ESEMPIO: miscelaformulata per essereinclusanellamatrice VINO

45. Risultati Principali - Task 2.3.2 e 5.1.2 (Lab.Instruments) • Task 2.3.2 e Task 5.1.2: sviluppo di metodiche multiresiduali basate sulla spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS) • Ottimizzazione delle condizioni strumentali (rivelazione in HRMS e MS/MS) mediante analisi delle soluzioni di fitofarmaci allestite nell’ambito delle Tasks 2.3.1 e 5.1.1. • Sviluppo di procedure di preparazione del campione (QuEChERs sviluppati dalla LabInstrument s.r.l.)

46. OR 5 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Cereali e Derivati OS 5.2: Messa a punto di una metodica multi-micotossina in cereali e derivati e produzione di materiali di riferimento Partner: • ISPA-CNR (Bari) • Lab. Instruments srl Soggetto attuatore: • D.A.Re. scrl

47. Avanzamento OS 5.2

48. Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013) • Task 5.2.1: Produzione di materiali di riferimento (farine di frumento e mais) multi-micotossina (M1-36) • stato: in corso (50% completamento) • Task 5.2.2: Sviluppo di metodichemultianalita LC-MS(MS) per micotossine in cereali e prodottiderivati (M1-36) • stato: in corso (50% completamento)

49. Risultati Principali- Task 5.2.1 (ISPA-CNR) • Task 5.2.1: Produzione di materiali di riferimento (farine di frumento e mais) multi-micotossina Per i livelli target ci si è riferiti ai regolamenti 1881/2006/EC (aflatossine e OTA), 1126/2007/EC (DON, ZEA, fumonisine) e alla raccomandazione 2013/165/EU (somma di T-2 e HT-2) delle quali sono stati considerati i limiti massimi stabiliti per frumento e mais destinati al consumo umano diretto.

50. Risultati Principali – Task 5.2.1 (ISPA-CNR) MAIS naturalmente contaminato da DON, FB1, FB2 (30 kg) Studio di OMOGENEITA’ STABILITA’ Estratti da colture di F. sporotrichioides (T2-HT2) F. gramienarum (DON-ZEA) flavus (AFs) A. parasiticus (AFs) A. ochraceous (OTA) Miscelazione e omogeneizzazione Suddivisione in aliquote da 80 g • La stessa strategia è stata utilizzata per la produzione del FRUMENTO contaminato da tossine di Fusarium e OTA