Transcriptional Control ใน Eukaryotes

1. Transcriptional Control ใน Eukaryotes

2. Gene Expression ใน Eukaryotic Cells • Controlโดย • Spatial & Temporal regulation • Transcriptional control ของ DNA • Alternate splicing ของ RNA • Cytoplasmic control ของ mRNA stability • Induction ของ transcriptional activity โดย environment และ biological factors

3. Spatial & Temporal Regulation • Spatial regulation: การแสดงออกของ genes แตกต่างกันเนื่องจากความจำเพาะของ เนื้อเยื่อ (tissue-specific expression) gene product ทุกอย่างไม่เป็นที่ต้องการของทุกเนื้อเยื่อ • Temporal regulation: การแสดงออกของ genes ในเวลาที่แตกต่าง แล้วแต่สิ่งกระตุ้น หรือช่วงพัฒนาการ

4. Transcriptional control ของ DNA ~ RNA polymerase & promoter • Alternate splicing ของ RNA ~ การตัดต่อ RNA เต็มวัย (maturation ของ RNA) • Induction ของ transcriptional activity ~ อุณหภูมิ, แสง, hormones ชักนำให้ genes แสดงออก โดยเฉพาะระหว่างพัฒนาการ (development)

5. Cytoplasmic control ของ mRNA stability • mRNA ถูกสลายง่าย จึงต้องมี transcription เพิ่มอยู่ตลอดเวลา • polypeptides ที่เป็นผลผลิตของ gene จะหยุดการสังเคราะห์ • polypeptides ที่มีมากเกินไปจะเป็นผลร้ายกับเซลล์ • การสลาย (degradation) mRNA จึงป้องกันการแสดงออกของ genes • mRNA stable โดย Poly-A tail และ Estrogen • mRNA ถูกสลายถ้ามี 3’ untranslated sequence AUUUA ซ้ำหลายครั้ง

6. Transcriptional in Eukaryotes Factors สำคัญคือ 1. RNA Polymerases 2. Promoters 3. Transcription Factors 4. Enhancers 5. Upstream promoter elements

7. 1. RNA Polymerase • RNA polymerase ใน Eukaryotic cell มี 3 types คือ RNA Pol I ใช้สังเคราะห์ rRNA precursor (18S + 28S + 5.8S) RNA Pol II ใช้สังเคราะห์ mRNA precursor RNA Pol III ใช้สังเคราะห์ tRAN precursor และ 5S rRNA precursor • RNA polymerase ทั้ง 3 ชนิดของ eukaryote ไม่มี • s factor • structure ต่างกัน • จำ promoter ต่างกัน

8. 2. Promoter • Promoter สำหรับ RNA Polymerase แต่ละชนิด ต่างกัน ที่ • Element(s) ซึ่งเป็น ลำดับพิเศษบน DNA หรือเป็นตำแหน่งที่ RNA polymerase จำได้ (recognition site) ในการเข้ามาจับที่ promoter เพื่อการ control ต่างกัน • ดังนั้น RNA polymerase แต่ละชนิดมี promoter เฉพาะ

9. 3. Transcription Factors • Transcription factor หรือ TF ช่วยการทำงานของ RNA Polymerase อย่างถูกต้อง เช่น • TATA-binding protein (TBP) • TFIIA --> TFIIH • โดยจับบน DNA ที่ • DNA binding domain และ • Transcription activation domain

10. 4. Enhancers and Silencers • เป็นส่วนของ DNA ที่ช่วย stimulate transcription จาก promoter แต่ไม่เป็นส่วนของ promoter • จัดเป็นความสัมพันธ์โดยระยะทางบน DNA (fixed spatial relationship)ในการ control genes อาจพบอยู่ได้หลายตำแหน่งบน DNA

11. Enhancer & Silencer

12. 5. Upstream promoter elements • เป็น binding site สำหรับ transcription factors ของ RNA polymerase II • ไม่เป็นส่วนของ promoter

13. Control ของ RNA Polymerase Iสำหรับ rRNA (18 S, 28 S และ 5.8 S) Promoter: มีส่วนควบคุม (control element) อยู่ที่ 2 blocks คือ 1) Core element (Core) : position ระหว่าง - 45 ถึง +20 สำหรับ RNA Polymerase 2) Upstream control element (UCE) : position ระหว่าง -156 ถึง -107 เพื่อให้ transcription มีประสิทธิภาพ • ทั้ง 2 blocks ไม่ปรากฎมี consensus sequence

14. RNA Pol I Promoter Human rRNA promoter: • RNA Polymerase I จับที่ -45 (downstream) ถึง +20 (upstream) • TIF-I จับที่ -67 (downstream) ถึง -14 (upstream) • ดังนั้น RNA Pol I - TIF-I complex จับบน promoter sequence ที่ -67 ถึง +20

15. Control ของ RNA Polymerase II Promoter: มี control element 2 แบบ แล้วแต่ genes 1. TATA box หรือ Hogness box ที่ -25 มี consensus sequence คือ TATAAAA ต้องการ upstream promoter element 21 bp (เป็น 3 repeats) ระหว่าง -40 และ -103 2. CAAT box consensus sequence (GC)CCAATCT ที่ -75

16. Control Elements ของ RNA Polymerase II Promoter

17. Initiation complex ของ RNA polymerase II • ต้องการ TBP และ TFII A --> H

18. Enhancer ของ RNA pol II: • Stimulate transcription จาก promoterไม่มี consensus sequences • เป็น tissue-specific เช่น mouse immunoglobulin enhancer แสดงออกใน immunoglobulin genes ในเซลล์ immune system แต่ไม่แสดงออกใน mouse connective tissue cell Enhancer Closed promoter

19. Enhancer • Enhancer ช่วย RNA polymerase เปิด promoter จึงเกิด transcription Opened Promoter

20. Control ของ RNA Polymerase III • Promoter: เป็น Internal promoter • 5S rRNA gene promoter: มี control element upstream และระหว่าง +55 ถึง +80 • tRNA gene promoter มี 2 blocks แยกกัน A block ระหว่าง +8 ถึง +30 และ Bblock ระหว่าง +51 ถึง +72

21. Posttranscriptional Control หรือ RNA Processing

22. Posttranscriptional Control in Eukaryote • RNA ที่ สร้างได้ใหม่ใน nucleus เรียกว่า Primarytranscript • ยังไม่แปรรูปใช้งานไม่ได้จะมีความยาวมาก • Primary transcript หรือ precursor ของ mRNA เรียกว่า Heterogeneous nuclear RNA (hnRNA)

23. Heterogeneous nuclear RNA (hnRNA)

24. mRNA Processing • hnRNA จะต้องถูก modified ต่อไปด้วย 3 ขั้นตอน คือ 1. Capping 2. Tailing 3. Intron Splicing

25. 1. Capping • การแปรรูปที่ปลาย 5’ โดยเติม Cap ซึ่งเป็น7-methylguanosine • ป้องกันถูกย่อยโดย nuclease • ให้ ribosome จำ mRNA ได้ และ • การขนส่ง mRNA ออกจาก nucleus ไป cytoplasm • Guanine triphosphonucleotide (GTP) จับที่ nucleotide ปลาย 5’ • Guanine (G) ถูกเติม CH3(methyl) เข้าที่ N7ของโมเลกุล

26. Capping & Methylation

27. Capping Reaction

28. 2. Tailing • กระบวนการเติ่ม Adenine จำนวนมากเข้าที่ปลาย 3’ end (trailer) ของ hnRNA เรียกว่า Polyadenylation • โดย poly-A polymerase • เพื่อ stability และ transportation RNA ออกจาก nucleus

29. Tailing ของ mRNA

30. 3. Intron splicing • Primary transcript ของ mRNA, tRNA และ rRNA มีส่วนเกินที่จะถูกตัดออกก่อน ให้เป็น mature RNA จึงทำงานใน cytoplasm ได้ • ส่วนเกิน หรือ noncoding sequence เรียกว่า Intronอยู่ระหว่าง coding sequences ซึ่งเรียกว่า Exon

32. mRNA Splicing

33. Intron แบ่งเป็น 4 กลุ่ม 1. Group I intron : intron มี 5’ UA และ 3’ G • nuclear rRNA precursor และ mitochondrail rRNA 2. Group II intron :intron มี 5’ G และ 3’ A-Nn-G • mitochondrial mRNA precursor 3. Nuclear mRNA intron : intron มี5’ G และ 3’ UACUAAC box (TACTAAC box บน DNA) • mRNA precursor ใน nucleus ของ eukaryotes 4. tRNA intron : ลักษณะเฉพาะตัว

34. Mechanism ของ Splicing 1. Self splicing โดย Autocatalytic property of intron เอง 1.1 ต้องการ Guanine-containing nucleotide (GMP, GDP, GTP) พบใน group I introns 1.1 ไม่ต้องการ Guanine-containing nucleotide พบใน group II introns

35. 2. Spliceosome: ต้องการ snRNA เป็นเอนไซม์ตัด และมี proteins เป็นส่วนประกอบ รวมเรียกว่า small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) หรือ Snurps หรือ Spliceosomes พบใน mRNA precursor 3. tRNA precursor splicing: ใช้ Splicing endonuclease และ Splicing ligase

36. Self-splicing ของ Group I intronต้องการ Guanine

37. Self-splicing ของ Group II intronไม่ต้องการ Guanine

38. Spliceosomeต้องการ Snurps โดย snRNA มี enzyme activity (Ribozyme)

39. Alternative Splicing ของ mRNAs • การตัด Introns หรือ ต่อ Exons อย่างสลับของ mRNA precursor • ในบางกรณี Splicing site ที่ 5’ และ 3’ บน intron อาจเปลี่ยนได้ ทำให้ gene 1 gene สามารถให้ mRNA หลายแบบเป็น Family ของ mRNAs • นั่นคือ 1 gene สามารถ code ให้ protein ได้หลายแบบที่คลายกันมาก ซึ่งเรียกว่า Protein Isoforms • เช่น Immunoglibulin genes code ให้ antibody หลายชนิด

40. Alternate Splicing

41. tRNA Splicing • Splicing endonuclease ตัดปลายทั้ง 2 ข้างของ intron • Splicing ligase ต่อปลายของ 2 exons เข้าด้วยกัน

42. Reverse Transcription

43. Reverse transcription สังเคราะห์ DNA โดยใช้ RNA เป็นแม่แบบ และ ใช้ RNA-dependent DNA polymeraseหรือ Reverse transcriptase (RT) DNA ที่ได้เรียกว่า Complementary DNA (cDNA) RNA tumor virus เมื่อเข้าไปในเซลล์จะสร้าง cDNA ก่อน แล้วจึงต่อ (integrate) เข้า DNA ของ host และ cDNA สามารถสังเคราะห์จาก mRNA ได้ในหลอดแก้ว (in vitro)

44. Reverse Transcription

45. Mechanism ของ Reverse Transcription

46. Central Dogma Update V. 2 V. 1 V. 3 V. 4 (forbidden)