تشخیص آزمایشگاهی عفونت های روده ای حمید بهرامی کارشناس ارشد آزمایشگاه

1. تشخیص آزمایشگاهی عفونت های روده ایحمید بهرامیکارشناس ارشد آزمایشگاه حمیندحم

2. جمع آوری نمونه • نمونه گیری مدفوع باید در مراحل اولیه بیماری های روده ای و قبل از شروع درمان آنتی بیوتیکی انجام شود. • نمونه مدفوع • سواب مدفوع • سواب رکتال

3. جمع آوری نمونه • نمونه مدفوع • نمونه مدفوع باید در ظرف پلاستیکی تمیز (نیاز به استریل بودن نیست). • ظرف باید فاقد مواد نگهدارنده، شوینده، یون های فلزی یا کاغذ توالت باشد. • نباید با ادارار مخلوط شود. • حداقل یک گرم مدفوع با قوام طبیعی (به اندازه یک فندق) یا 5 سی سی مدفوع اسهالی برای کشت نیاز است. • نمونه باید تازه باشد و در مدت 30 دقیقه به خصوص برای شیگلا و حداکثر 2 ساعت بعد از نمونه گیری باید کشت داده شود. • نمونه هایی که نمی توان به فاصله 2 ساعت کشت داد باید به محیط انتقالی منتقل کرد.

4. جمع آوری نمونه • سواب مدفوع • سواب را داخل مدفوع قرار داده و پس از حرکت چرخشی مقدار از آن را بردارید و در صورت مشاهده موکوس باید از آنها نیز نمونه برداشت. • سواب را تا انتهای محیط انتقالی برده و قسمت بالایی چوب را که با انگشتانتان لمس کرده اید را بشکنید و در پیچ لوله را کاملا ببندید. لوله را بلافاصله در یخچال قرار دهید. • نکته: برای جداسازی بهتر ترجیحا تا 24 ساعت پس از نمونه گیری کشت داده شود حداکثر این گونه از نمونه ها تا 3 روز قابل نگه داری می باشد.

5. جمع آوری نمونه • سواب رکتال • در صورت استفاده از سواب رکتال به جای نمونه مدفوع، از سواب پنبه ای سالم استفاده نمایید و دقت کنید که پنبه آن کنده نشده باشد. • ابتدا سواب را با فرو کردن در محیط انتقال استریل مرطوب کرده، سپس به اندازه 2 الی 3 سانتی متر داخل رکتوم فرو برید و به آرامی بچرخانید تا با مخاط انتهای رکتوم تماس یابد، سپس سواب را خارج کنید و با توجه به تغییر رنگ سواب مطمئن شوید سواب به مدفوع آغشته شده باشد. • حداقل دو سواب باید از بیمار گرفت و هر دو را در یک لوله حاوی محیط انتقال قرار داد.

6. محیط انتقال Carry – Blair • محیط کری بلر با پی اچ 8/4 محیط انتقال مناسب برای بسیاری از عوامل بیماری زای روده ای می باشد. • مطابق دستورالعمل سازنده تهیه کنید داخل لوله باید به اندازه ای ریخته شود که حداقل 4 سانتی متر عمق داشته باشد.

7. بررسی ماکروسکوپی و میکروسکوپی مدفوع • ماکروسکوپی: نمونه های مدفوع باید از نظر ظاهر بررسی گردند و از نظر وجود لخته خون، موکوس و قوام مدفوع مشاهدات ثبت شود. • میکروسکوپی: با تهیه یک اسمیر نازک از مدفوع و رنگ آمیزی گرم می توان وجود گلبول های سفید، همچنین غالب بودن یک مورفولوژی باکتریایی، وجود سلول های مخمر یا عدم وجود باسیل های گرم منفی روده ای را تعیین نمود.

8. محیط کشت • محیط های کشت پلیتی افتراقی و انتخابی • محیط های مایع غنی کننده

9. محیط کشت • محیط های کشت پلیتی افتراقی و انتخابی: • محیط کشت مکانکی که همه باسیل های گرم منفی روده ای بتوانند روی آن رشد کنند همراه با محیط افتراقی – انتخابی • XLD (Xylose – Lysine Decarboxylate) • از محیط HE (Hektoen Enteric Agar) به جای XLD می توان استفاده نمود.

10. محیط کشت تذکر: • محیط SS آگار برای جداسازی سالمونلا به کار می رود، اما باعث مهار رشد برخی از شیگلاها می شود. • چون محیط XLD میزان مهار کنندگی کمتری روی رشد کلی فرم ها دارد، برای جداسازی شیگلا مناسب تر از محیط HE می باشد.

11. محیط کشت • محیط های مایع غنی کننده: • رایجترین این محیط ها GN (Gram Negative Broth) براث و • SF (Selenit F Broth) براث می باشند.

12. محیط کشت تذکر • محیط SF براث برای جداسازی سالمونلا مناسب است ولی برای برخی از گونه ها شیگلا دارای اثر مهار کنندگی بوده، لذا بهتر است در موارد مشکوک به شیگلا از این محیط استفاده نشود. • هنگام ساخت محیط SF براث، حرارت دادن بیش از حد باعث ایجاد ذراتی در محیط می شود که در این صورت نمی توان از آن استفاده کرد. عمق محیط باید حداقل 5 سانتی متر باشد.

13. تلقیح به محیط کشت (تلقیح محیط های پلیتی) • سواب آغشته به مدفوع را روی پلیت به قطر حدود 2.5 سانتی متر می چرخانیم. با استفاده از لوپ استریل از منطقه تلقیح در تمامی پلیت Streak کرده به طوری که کلنی های جدا از هم بدست آید. • برای استریل کردن لوپ را با شعله استریل کرده و اجازه دهید تا کاملا سرد شود. • پلیت ها را به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 - 35 درجه سانتیگراد قرار می دهیم. در صورت عدم رشد یا رشد ضعیف، انکوباسیون را تا 48 ساعت ادامه می دهیم.

14. تلقیح به محیط کشت (تلقیح محیط های پلیتی) تذکر: • برای هر بیمار استفاده از یک پلیت با قطر 10 – 8 سانتیمتری الزامی است و نباید از پلیت 6 سانتی متری استفاده نمود زیرا احتمال جداسازی کاهش می یابد. • برای تلقیح در محیط انتخابی باید مقدار بیشتری نمونه تلقیح شود. • در مواردی که نمونه مدفوع قوام دارد توصیه می شود کشت از سوسپانسیون مدفوع در سرم فیزیولوژی انجام گردد.

15. تلقیح به محیط کشت (تلقیح محیط مایع غنی کننده) • نمونه را با سواب به داخل محیط برده مخلوط می کنیم و سواب را دور می اندازیم. • معمولا برای محیط GN براث 6 – 4 ساعت انکوباسیون و محیط SF براث 12 – 8 ساعت انکوباسیون در 37 – 35 درجه سانتیگراد توصیه می شود. • بعد از این زمان از سطح براث یک لوپ برداشته، روی پلیت MAC و XLD کشت می دهیم، به طوری که کلنی های جدا از هم به دست آید. به مدت 24 ساعت انکوبه می کنیم در صورت عدم رشد یا رشد ضعیف، انکوباسیون را تا 48 ساعت ادامه می دهیم.

16. باکتری • اشریشیا (Escherichia) • شیگلا (Shigella) • سالمونلا (Salmonella) • ویبریوکلرا (Vibrio cholera)

18. اشریشیا (Escherichia) • اشریشیا کولی بیشترین گونه های باکتریایی هستند که در آزمایشگاه جدا می شوند. • اشریشیا کولی برا اساس آنتی ژن سطحی O به بیشتر از 170 سروگروپ تقسیم می شود. • با ترکیبی از آنتی ژن O و آنتی ژن H اشریشیا کولی را به صورت سروتیپ تقسیم بندی می کنند مانند E.Coli O157:H7.

19. اشریشیا کولی و عفونت های روده ای • سویه های معینی از اشرشیا کولی با شش مکانیسم متفاوت می تواند باعث سندرم های بالینی مختلف شوند. • EntertoxigenicE.Coli (ETEC) • EnteropathogenicE.Coli (EPEC) • EnteroinvasiveE.Coli(EIEC) • EnterohemorrhagicE.Coli (EHEC) • EnteroaggregativeE.Coli (EAEC) • Diffusely adherent E.Coli (DAEC)

20. اشریشیا کولی و عفونت های روده ای نکته • علیرغم اینکه شناسایی همه سویه های ذکر شده در دسترس می باشد اما در بیشتر موارد نیاری به شناسایی سویه های پاتوژن E.Coli نمی باشد. بیشتر بیماران با عفونت گوارشی ناشی از E.Coliبدون درمان و یا با آنتی بیوتیک های رایج درمان می شوند. بنابراین به جز شناسایی سروتایپ EHEC نیازی به شناسایی سایر سویه های E.Coli نمی باشد.

21. اشریشیا کولی و عفونت های روده ای • E.ColiO157:H7 شیگا توکسین تولید می کند. • ایجاد اسهال خونی بدون گلبول سفید. • تب ایجاد نمی کند. • درد شکمی دارد. • ممکن است HUS را ایجاد نماید. • مهمترین مشخصه آن سوربیتول منفی بودن است.

22. شیگلا (Shigella) • گونه های شیگلا لاکتوز منفی بوده و از نظر بیوشیمیایی معمولا منفی می باشند. • آنها به طور معمول از کربوهیدرات ها گاز تولید نمی کنند به جز فلکسنری. • همگی لاکتوز منفی هستند به جز سونئی که به آهستگی در 2 درصد مواقع قادر به تخمیر لاکتوز می باشد.

23. شیگلا (Shigella) برای جنس شیگلا چهار ساب گروه اصلی و 43 سروتیپ شناخته شده است. • گروه A: شیگلا دیسانتری • گروه B: شیگلا فلکسنری • گروه C: شیگلا بویدی • گروه D: شیگلا سونئی

24. تشخیص شیگلا (Shigella) • کلنی های شیگلا بر روی محیط مکانکی بی رنگ یا هم رنگ محیط با قطر 3-2 میلیمتر، روی محیط HE سبز یا آبی – سبز (سبزتر از کلنی سالمونلا) بدون مرکز سیاه و روی محیط XLD قرمز بدون مرکز سیاه با قطر 2 – 1 میلی متر می باشند. • کلنی شیگلا دیسانتری سروتایپ 1 روی این محیط ها کوچکتر بوده و معمولا روی محیط های با میزان مهار کنندگی کمتر مانند مکانکی بهتر رشد می کنند.

25. تشخیص شیگلا (Shigella)

26. تشخیص شیگلا (Shigella) کلنی شیگلا روی محیط HE

27. تشخیص شیگلا (Shigella) • جهت انجام تمامی آزمایش های بیوشیمیایی باید یک کلنی کاملا ایزوله مشکوک به شیگلا را از پلیت های MAC یا XLD یا ... به دقت انتخاب کرده و آنس را به وسط کلنی تماس دهید از آن سوسپانسیونی در 0.5الی 1 سی سی سرم فیزیولوژی استریل تهیه و برای انجام آزمایش های بیوشیمیایی استفاده کنید. • اگر کلنی کاملا ایزوله روی محیط وجود ندارد می توانید از کلنی مشکوک برداشته روی پلیت دیگر استریک کنید تا کلنی خالص به دست آورید و سپس از آن برای افتراقی استفاده نمایید.

28. تشخیص شیگلا (Shigella) TSI / KIA • با فرو کردن آنس به عمق محیط و سپس استریک کردن روی سطح شیب دار تلقیح را انجام دهید و پس از 24 – 18 ساعت انکوباسیون در 37 – 35 درجه سانتیگراد واکنش را بررسی نمایید. • در طی انکوباسیون محیط KIA یا TSI باید در لوله یا پنبه آن برای تهویه شل باشد، در غیر اینصورت نتایج گمراه کننده ای به دست می آید.

29. تشخیص شیگلا (Shigella) TSI / KIA • حجم محیط KIA یا TSI در لوله باید به اندازه ای باشد که عمق و سطح شیب دار حداقل 3 سانتی متر باشد. • سویه های شیگلا بر روی این دو محیط به صورت Alk/Acid سطح قرمز عمق زرد بدون تولید گاز و H2S می باشند. • بعضی از سویه های شیگلا فلکسنری و موارد استثنایی از شیگلا بوییدی در این دو محیط گاز تولید می کنند. هم چنین سویه های سونئی لاکتوز را در انکوباسیون های طولانی تخمیر می کنند.

30. تشخیص شیگلا (Shigella)

31. تشخیص شیگلا (Shigella) LIA • حجم محیط باید به مقداری باشد که محیط دارای 4 سانتی متر عمق و 2 سانتی متر سطح باشد. همچنین تلقیح باید دو بار در عمق محیط و یک بار روی سطح انجام شود تا شرایط بی هوازی لازم ایجاد گردد. همه سویه منفی هستند.

32. تشخیص شیگلا (Shigella) اوره • گزارش واکنش اوره از روی محیط اوره آگار می باشد در تعیین واکنش اوره آز محیط اوره آگار از براث حساس تر است. حرکت • بوسیله آنس از کلنی مشکوک برداشته و 1 الی 2 سانتی متر به داخل محیط انتقال دهید زمان انتقال نباید سطح محیط مرطوب باشد زیرا باعث می شود باکتری روی سطح محیط پخش شود و نتایج اشتباه به دست آید.

33. تشخیص شیگلا (Shigella) اندول • متفاوت هستند. متیل رد • همه سویه ها مثبت هستند. VP • همه سویه منفی هستند. سیترات • همه سویه منفی هستند. ONPG • شیگلا سونئی مثبت است. 15 درصد از دیسانتری ها مثبت اند. 8 درصد از بوییدی ها مثبت اند.

34. تشخیص شیگلا (Shigella) تعیین سروگروه بوسیله آگلوتیناسیون بر روی لام با آنتی سرم های سوماتیک O شامل: • Poly group A • Poly group B • Poly group C • Poly group D

35. تشخیص شیگلا (Shigella) تعیین سروگروه • قبل از انجام آزمایش با آنتی سرم، باید بروشور داخل بسته آنتی سرم را به دقت مطالعه نمایید. • برای انجام آزمایش یک لام تمیز برداشته و روی یک سمت آن یک قطره سرم فیزیولوژی و سمت دیگر آن یک قطره آنتی سرم قرار دهید.

36. تشخیص شیگلا (Shigella) تعیین سروگروه • کلنی ها را از روی محیط TSI یا KIA و یا محیط ساده دیگر انتخاب نمایید توجه داشته باشید به هیچ وجه نباید از کلنی های روی محیط های انتخابی استفاده نمود زیرا نتایج گمراه کننده به دست می آید. • بوسیله لوپ، آنس یا اپلیکاتور چوبی کمی کلنی برداشته ابتدا در سرم فیزیولوژی سپس در آنتی سرم سوسپانسیون یکنواختی تهیه کنید. لام را به مدت 30 الی 60 ثانیه به صورت دورانی حرکت دهید. • تشکیل ذرات آگلوتیناسیون را زیر نور چراغ مطالعه به دقت بررسی کنید. مطمئن شوید که قطره سوسپانسیون سرم فیزیولوژی فاقد ذرات آگلوتیناسیون باشد.

37. تشخیص شیگلا (Shigella) تعیین سروگروه تذکر • اگر در قطره سرم فیزیولوژی ذرات آگلوتیناسیون ایجاد شود، واکنش آگلوتیناسیون خود بخودی است که به علت کلنی خشن ایجاد می شود. گاهی اوقات استفاده از محیط های حاوی قند زیاد مانند TSI یا KIA می تواند باعث ایجاد آگلوتیناسیون خودبخودی شود بنابراین لازم است کلنی بر روی محیط های ساده ساب کالچر شود و سپس مورد بررسی آنتی سرم قرار گیرد.

38. تشخیص شیگلا (Shigella) تعیین سروگروه تذکر • در سویه هایی که از نظر بیوشیمیایی شبیه شیگلا هستند ولی با آنتی سرم جواب نمی دهند احتمال پوشیده شدن آنتی ژن O توسط آنتی ژن کپسولی وجود دارد. برای از بین بردن آنتی ژن کپسولی باید: سوسپانسیون غلیظی از سویه جدا شده در سرم فیزیولوژی تهیه نموده و در دمای 100 درجه به مدت 15 دقیقه حرارت داده شود بعد از خنک شدن سوسپانسیون یک قطره از آن را در یک قطره نرمال سالین از نظر اتو آگلوتینه بررسی نمایید در صورت منفی بودن آن را با آنتی سرم مجاور کنید. • همه آنتی سرم ها باید قبل از استفاده با سوش های مثبت و منفی مورد ارزیابی و کنترل قرار گیرد.

39. تشخیص سالمونلا (Salmonella) • جنس سالمونلا دارای دو گونه است: انتریکا و بنگوری • سالمونلا انتریکا دارای 6 زیر گونه است که زیر گونه I آن معمولا از انسان جدا می شود. • سالمونلا از نظر تست های بیوشیمیایی و نحوه گزارش اولیه به سه گروه تقسیم می شوند: • NontyphoidalSalmonella • SalmonellaTyphi • SalmonellaParatyphi A

40. تشخیص سالمونلا (Salmonella) • کلنی سویه های سالمونلا بر روی محیط مکانکی بی رنگ یا هم رنگ محیط، HE آبی یا سبز آبی با مرکز سیاه و XLD قرمز با مرکز سیاه می باشند. (در مواردی ممکن است تولید H2S تا 48 ساعت بعد صورت بگیرد.)

41. تشخیص سالمونلا (Salmonella) سالمونلا روی محیط XLD با هاله صورتی اطراف آن

42. تشخیص سالمونلا (Salmonella) KIA / TSI • اکثر سویه های سالمونلا بر روی این دو محیط وکنش + H2S، + Gas و Alk/Acid ایجاد می کنند. • سالمونلا تیفی روی این دو محیط واکنش قلیا اسید بدون تولید گاز و مقدار کم H2S در خط تلقیح آنس ایجاد می نمایند. سالمونلا پاراتیفی A نیز بدون H2S یا خیلی ضیف می باشد.

43. تشخیص سالمونلا (Salmonella) LIA • همه سالمونلا به جز سالمونلا پاراتیفی A لیزین را دکربوکسیله می کنند و اغلب H2S تولید می کنند. اوره • همه سالمونلاها اور آز منفی می باشند. حرکت • به غیر از گالیناروم و پولوروم همه حرکت مثبت اند. اندول • همه سالمونلاها اندول منفی اند.

44. تشخیص سالمونلا (Salmonella) متیل رد • همه سالمونلاها واکنش متیل رد مثبت دارند. VP • همه سالمونلاها واکنش VP منفی دارند. سیترات • اکثر سالمونلاها از سیترات به عنوان منبع کربن استفاده می کنند، اما برخی از سرو تیپ ها مانند تیفی، پارا تیفی A منفی اند.

45. تشخیص سالمونلا (Salmonella) نکته: • به علت تشابه سیتروباکتر با سالمونلاها در آنتی ژن های H، O یا V تشخیص بیوشیمیایی سالمونلا قبل از استفاده از آنتی سرم بسیار حائز اهمیت است.

46. تشخیص ویبریوکلرا (Vibrio cholera) محیط های کشت • آب پپتونه قلیایی (APW) Water AIkaline Peptone • محیط کشت آگار دار ( TCBS)

47. تشخیص ویبریوکلرا (Vibrio cholera) نحوه کشت مدفوع • نمونه مدفوع و سوآپ رکتال را روی محیط (TCBS) برده و ایزوله نموده سپس مقداری هم داخل محیط APW ) ) تلقیح نمایید (تلقیح مدفوع نباید از 10% کل حجم آبگوشت بیشتر باشد) • در پیچ لوله (APW) را نیمه باز به مدت 6 الی 8 ساعت در 35 درجه انکوبه نموده و نمونه را جهت کشت روی( TCBS) آماده کنید.

48. تشخیص ویبریوکلرا (Vibrio cholera) نحوه کشت مدفوع • حلقه رویی تشکیل شده در (APW) که غنی از ویبریو است را روی محیط ( TCBS) کشت دهید توجه شود که (APW) را نباید به هم زد یا مخلوط نمود. ضمناً در صورت عدم انتقال به مدت 6 الی 8 ساعت انکوباسیون بایستی پس از 18 ساعت و تشکیل حلقه کامل، آن را روی (APW) دوم برده و 6 الی 8 ساعت بعد عمل انتقال ( TCBS) را انجام دهید، که سبب تاخیر مراحل تشخیصی می شود.

49. تشخیص ویبریوکلرا (Vibrio cholera) نحوه کشت مدفوع • محیط ( TCBS) اولیه و همچنین ( TCBS) ساب کالچر از( APW) را بعد از 18 الی 24 انکوباسیون جهت دیدن کلنی های زرد براق بررسی نمایید رنگ زرد کلنی نشانه تخمیر سوکروز محیط است. • توجه شود کلنی های به غیر از رنگ زرد (عدم تخمیر سوکروز) جهت شناسایی افتراقی ویبریو بکار گرفته نمی شود.

50. تشخیص ویبریوکلرا (Vibrio cholera) جداسازی ویبریوکلرای مشکوک • از کلنی زرد توسط آنس نوک تیز بدون تماس با سطح ( TCBS) نمونه را برداشته و در محیط KIA و (HIA) AgarInfusionHeart یا محیط غیر انتخابی دیگر به جز محیط های آگار مغذی که نمک اضافی ندارند کشت دهید. • محیط کشت HIA KIA , را به مدت 24 ساعت در 35 درجه انکوبه نموده و کلنی هایی که در روی KIAبصورت K/A ( سطح قرمز و عمق زرد) می باشد را از نظر سرم شناختی با آنتی سرم های چند ظرفیت O1و O139 مورد مطالعه قرار دهید (از روی محیط (HIA. • اگر موجودی آنتی سرم ها محدود باشد آزمایش اکسیداز برای غربالگری موارد جدا شده پیش از آزمایش با آنتی سرم کمک کننده است.