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辽宁中医药大学附属医院 肿瘤科 · 潘玉真

柴胡龙牡汤 对 小鼠 Lewis 肺癌细胞凋亡的影响及其机制的实验研究. 辽宁中医药大学附属医院 肿瘤科 · 潘玉真. 柴胡龙牡汤前期研究. 研 究 背 景. 临床运用柴胡龙牡汤治疗存在咳嗽、咳痰等 肺 经症状的肺癌患者 43 例，显效 5 例 （ 12% ）， 有效 31 例 （ 72% ）， 无效 7 例 （ 16% ）， 总有效率（显效＋有效）达 84% [1] 。 体内实验研究已证实，该药具有抑制 Lewis 肺癌细胞生长的作用，对荷瘤小鼠的抑瘤率可达 31.4% [2] 。.

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  1. 柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响及其机制的实验研究柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响及其机制的实验研究 辽宁中医药大学附属医院 肿瘤科 · 潘玉真

  2. 柴胡龙牡汤前期研究 研 究 背 景 • 临床运用柴胡龙牡汤治疗存在咳嗽、咳痰等肺 经症状的肺癌患者 43例，显效 5例（12%），有效 31例（72%），无效 7例（16%），总有效率（显效＋有效）达 84%[1]。 • 体内实验研究已证实，该药具有抑制 Lewis 肺癌细胞生长的作用，对荷瘤小鼠的抑瘤率可达 31.4%[2]。 [1]调整气机治疗肺癌肺经症状43例临床研究. 秦海运，殷东风;实用中医内科杂志, 2009,23(4)80-82 . [2]肺积宁方对C57小鼠肺癌VEGF蛋白表达和生存质量的影响．现代肿瘤医学，2009, 17（6）：1042-1045.

  3. 中药与细胞凋亡的研究 研 究 背 景 肿瘤的发生不仅因细胞过度增殖，还与细胞凋亡机制受到抑制不能正常进行细胞死亡清除有关 细胞凋亡与肿瘤 细胞凋亡过程多因素、多基因联合作用结果。中药复方成分更为复杂，其作用多环节、影响细胞凋亡方面可能更为有效 中药与细胞凋亡 辽宁中医药大学附属医院 www.themegallery.com

  4. 实 验 材 料 实 验 动 物 C57BL/6J近交系小鼠，共60 只，4 - 6周龄，清洁级，体重 18-20 g，雌雄各半。 中国医学科学院医学实验动物研究所提供，饲养于辽宁中医药大学实验动物中心。 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学 www.themegallery.com

  5. 瘤 株 Lewis 肺癌瘤株 ( Lewis Lung carcinoma LLC ) ，为小鼠来源的上皮样肺腺癌细胞。 由中国医科大学免疫教研室提供。 实 验 材 料 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学 www.themegallery.com

  6. 柴胡龙牡汤 药物组成：由柴胡、龙骨、牡蛎、黄芩、半夏、太子参、桔梗、炙甘草等11味中药组成。 药物煎煮方法：先后用 10 倍水煎 60 min 、8倍水煎煮 40 min，合并煎煮液，过滤后，浓缩至 1.0 g 生药 / ml，置于4 ℃冰箱保存备用。 实 验 药 品 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学 www.themegallery.com

  7. 顺 铂 顺铂(DDP)：齐鲁制药有限公司产品, 制剂规格为10 mg / ml 。 每次给药前用 0.9%生理盐水，把10mg顺铂稀释成1mg / ml顺铂注射液备用。 实 验 药 品 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学 www.themegallery.com

  8. 动 物 造 模 细胞株的复苏及C57BL/6J小鼠体内传代 -80℃冰箱 37℃水浴箱 注入小鼠腹腔中， 每只小鼠注射0.2ml。 离心两次 每次5min 加入2ml生理盐水 吹打混匀 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学 www.themegallery.com

  9. 动 物 造 模 模型制备 腹部隆起 明显的小鼠 无菌抽取 小鼠腹腔积液 镜下调整细胞浓度 为1×107/ml 0.2ml/只，接种于 小鼠右侧腋部皮下 辽宁中医药大附属医院 辽宁中医药大学 www.themegallery.com

  10. 动 物 分 组- 共分5组 模型组 中药组 化疗组 综合组 正常组 柴胡龙牡汤＋顺铂综合组 肺癌模型组 中药柴胡龙牡汤组 单纯顺铂化疗组 正常对照组 接种肺癌瘤株，不做治疗处理。 接种肺癌瘤株，并中药治疗。 接种肺癌瘤株，并化疗。 接种肺癌瘤株，中药联合化疗处理。 不做造模及治疗处理。 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学 www.themegallery.com

  11. 实 验 给 药 柴胡龙牡汤0.4ml /只/d（含生药0.4g）灌胃，共连续12天。 第1、3、5天，生理盐水0.1ml /只/d，腹腔注射。 中药组 化疗组 顺铂注射液0.1ml /只/d（DDP 0.1mg）腹腔注射化疗，共3次，于第1、3、5天给药。 同时生理盐水0.4ml/只/d灌胃，共12天 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学 www.themegallery.com

  12. 实 验 给 药 综合组 顺铂注射液给药剂量、方法同化疗组，柴胡龙牡汤用法同中药组 。 模型组 0.9%生理盐水0.4ml /只/d灌胃，共连续12天。 并于第1、3、5天， 0.9%生理盐水0.1ml /只/d，腹腔注射。 正常组 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学 www.themegallery.com

  13. 实 验 取 材 各组小鼠均于末次给药后24小时进行取材 完整剥离出瘤体，称重后于冰盒上，将瘤块切开在无坏死区共取材 3 份，标本块大小约为1 mm3。 Text 立即置于-20℃冰箱中冻存备用。 蛋白测定 于戊二醛固定液中，4℃冷藏备用。 电镜检测 置于甲醛固定液中备用。 免疫组化检测 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学 www.themegallery.com

  14. 统 计 分 析 统计学分析采用SPSS11.0软件包。 计量资料 进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间比较采用最小显著差法（LSD）方法。 等级资料 采用非参数统计方法--秩和检验 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学 www.themegallery.com

  15. 实 验 指 标 探讨柴胡龙牡汤诱导Lewis肺癌细胞凋亡的分子作用机制 透射电镜下观察肿瘤组织超微结构变化 检测肿瘤组织中 TNFα的蛋白表达，采用免疫组织化学法 凋亡相关基因 Bax、 Bcl-2、Caspase3蛋白表达，用 Western blot方法 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学

  16. 结 果 肿瘤细胞透射电镜观察 模型组- Lewis肺癌细胞 呈现出恶性肿瘤细胞特征。细胞核明显增大，核浆比例失调，核膜完整，双层核膜清晰，核异形性明显，细胞膜完整，胞质内线粒体肿胀 嵴断裂消失，偶见粗面内质网，散在核糖体颗粒。 粗面内质网 线粒体 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学

  17. 结 果 肿瘤细胞透射电镜观察 中药组- 凋亡细胞 呈现出细胞凋亡早期的特点。细胞体积明显缩小，细胞膜结构完整，核膜稍扩张，核形不规整，核内异染色质增多、边集，浓缩成团块状或新月状，分布在核膜的内侧。细胞质内细胞器基本正常。H异染色质 异染色质 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学

  18. 结 果 肿瘤细胞透射电镜观察 化疗组 - 坏死细胞 细胞体积异常增大，核大畸变，胞质内线粒体、粗面内质网扩张，核糖体颗粒脱落。 说明存在重度的炎性反应。 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学

  19. 结 果 肿瘤细胞透射电镜观察 凋亡小体 凋亡小体 凋亡小体 综合组 - 凋亡小体 化疗组 - 凋亡小体 中药组 - 凋亡小体 凋亡小体：由膜包绕，小体内可见核的残片及胞质。 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学

  20. 结 果 瘤组织中TNFα的免疫组化染色 TNFα 阴性 (400×) TNFα 阳性 (400×) 细胞浆无棕色与背景着色一致 细胞浆内出现均一的棕黄色和深棕褐色颗粒状染色 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学

  21. 瘤组织中TNFα的免疫组化染色结果  组别N TNFα染色结果 模 型 组 10 --- 中 药 组 10 ++ 化 疗 组 8 --- 综 合 组 9 ++ 结 果 结果分为4级: 未见阳性细胞为(-)； 阳性细胞数 ＜ 25% 为(+)；阳性细胞数在 25% ～ 50% 之间为(++)；阳性细胞＞ 50%为(+++)。 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学

  22. 结 果 Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表达电泳图 1 2 3 4 模型组 中药组 化疗组 综合组 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学

  23. — ( x ±S ) 结 果 瘤组织中Bcl-2、Bax及Caspase3 蛋白表达结果 组别N Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax Caspase3 模 型 组 10 189.62±19.19 ☆△ 78.45±9.55 ★△2.41 31.12±4.60 ★△ 中 药 组 10178.34±18.28◆ △ 114.40±13.59◇▲ 1.56 47.20±5.80◇ △ 化 疗 组 8158.45±16.9 ◇★ 121.60±13.38◇☆1.30 60.65±7.35◇★ 综 合 组 9 145.22±14.63◇★ 133.6±14.63◇★ 1.08 81.03±10.3◇★ △ △ △ 与模型组比较：◇p ﹤0.01， ◆p﹤0.05；与中药组比较： ★p﹤0.01，☆p﹤0.05；与化疗组比较：△p﹤0.01， ▲p﹤0.05。 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学

  24. 瘤组织中Bcl-2、Bax及Caspase3 蛋白表达结果  结 果 ☆ ★ ★ ★ ☆ 与中药组比较：★ p﹤ 0.01； ☆ p ﹤ 0.05。 ★ ★ ★ ★ 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学

  25. 讨 论 肺积的病因病机  病因 血瘀 邪毒 痰湿 肺的宣发肃降功能失司，气机紊乱而发病 正气内虚 辽宁中医药大学 www.themegallery.com

  26. 讨 论 柴胡龙牡汤的理、法、方、药  气机升降 《, 素问·六微旨大论》“非出入则无以生长壮老已,非升降则无以生长化收藏” 升降平衡理论 丹溪《局方发挥》“ 一升一降, 无有偏性, 是谓平人。” 导致五脏六腑、阴阳气血的功能活动紊乱、障碍, 从而产生相应的种种病理变化。 升降出入动态失衡 调畅气机 辽宁中医药大学 www.themegallery.com

  27. 讨 论 柴胡龙牡汤的理、法、方、药  龙骨 牡蛎 柴胡 升散之力 升降相宜，气机畅达 柴胡龙牡汤 调畅气机 疏肝宣肺 镇惊安神 软坚散结 软坚散结重镇降逆 桔梗 化痰止咳，可引药于肺经 一升一降以开宣肺气 半夏 可行气化痰，镇咳止吐 通利三焦、开三焦之结气。 黄芩 入肺经，可清肃肺热 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学 www.themegallery.com

  28. 细胞凋亡信号传导途径 讨 论 讨 论

  29. 1 2 结 论 柴胡龙牡汤可诱导Lewis肺癌细胞凋亡，对顺铂化疗具有协同增效作用。 柴胡龙牡汤可诱导 TNFα 产生，下调 Bcl-2 蛋白的表达，明显增加Bax及 Caspase3 的表达，从而使Bcl-2/ Bax 的比值降低，最终导致细胞凋亡。 辽宁中医药大学附属医院 辽宁中医药大学

  30. Thank you!

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