1 / 69

定量聚合酶链反应 (Q-PCR) 测定技术 及其临床应用

定量聚合酶链反应 (Q-PCR) 测定技术 及其临床应用. 卫生部临床检验中心 李金明. PCR?. PCR 只是一个简单的不起眼玩艺 —— 凯利 · 穆利斯（ Kary Mullis) PCR 只是一个概念，所发生的奇迹是： PCR 概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 … 它最大的特点就是能不断推出新形式。 —— 摘自 [Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow]. （ Kary Mullis). 什么是 PCR?.

gaura
Download Presentation

定量聚合酶链反应 (Q-PCR) 测定技术 及其临床应用

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 定量聚合酶链反应(Q-PCR)测定技术及其临床应用定量聚合酶链反应(Q-PCR)测定技术及其临床应用 卫生部临床检验中心 李金明

  2. PCR? PCR只是一个简单的不起眼玩艺 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 … 它最大的特点就是能不断推出新形式。 —— 摘自[Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow]

  3. （Kary Mullis)

  4. 什么是PCR? 我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。……它的发明并没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们能在更广的范围内更快、更容易地进行基因操作，学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一种新工具。 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis)

  5. PCR及有关技术的发展历史（1） 1983 Cetus 公司的 K. Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。 “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。 --KB Mullis, Scientific American, april 1990

  6. PCR发明过程的简单回顾

  7. PCR及有关技术的发展历史（2） • 关于PCR 的文章首次由Cetus公司Saiki等人在 Science 上 发 表 (R. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K. Mullis, G. Horn, H. Erlich and N. Arnheim) 1987 KB Mullis et al.”Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155:335

  8. PCR及有关技术的发展历史（3） 1987 当年7月Cetus 公司在美国获得PCR基本技术专利批准。 1985年底成立的Perkin-Elmer Cetus仪器公司 （ PECI ） 于这一年的11月推出了第一 个PCR试剂产品及第一台热循环仪。 1989 Science 报道了耐热性DNA多聚酶 Taq 酶的发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。 Hoffmann-La Roche 公司和Cetus 开 始合作将PCR应用于临床诊断 。 RK Saiki, … KB Mullis et al. (1988) ”Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermo-stable DNA polymerase”, Science 239:487

  9. Taq DNA polymerase Thermus aquaticus

  10. Taq DNA polymerase – A thermostable DNA polymerase from Thermus aquaticus.

  11. PCR及有关技术的发展历史（4） • DuPont理由是，1971年PCR的雏形已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。

  12. PCR及有关技术的发展历史（5） Study on polynucleotides: repair replication of short synthetic DNA’s as catalyzed byDNA polymerases. J Mol Biol, 1971, 56:341 “经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 核酸体外扩增最早设想不能实现的原因: 当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物； 当时(1970)Smith等发现了内切酶，体外克隆基因成为可能 H.G. Khorana美国MIT教授、1968年诺贝尔医学奖得主

  13. The article from 1971 in which Kleppe et al. describe Repair replication – basically the same principle as PCR! J. Mol. Biol. (1971) 56 341-361

  14. PCR及有关技术的发展历史（6） 1990 Cetus科学家 D.Gelfand和S.Stoffel发明了纯 化Taq DNA 多聚酶的方法。 Cetus 科学家H. Erlich 和K. Mullis在德国临床化学领域获得生化分析奖。 1991 TaqMan技 术 发 表。 当年11月Hoffmann-La Roche公司从Cetus获得全球 的PCR专利权。 Roche Molecular Systems 创建了单一耐热多聚酶rTth 进行RT-PCR技术，并用于临床RNA病毒检测。 耐热逆转录酶首次由Cetus科学家发现并报道。

  15. 实时荧光PCR技术 1986年末 Russ Higuchi来到PCR的诞生地Cetus公司工作 探讨“闭管PCR”的可能 “溴化乙锭”的使用 光导纤维的使用

  16. PCR及有关技术的发展历史（7） 1992 当年3月Cetus 公司获得Taq酶、热循环扩增仪等专利； 1993 AMPLICOR HCV*首次用于临床RNA PCR 标准试剂盒。 Kary Mullis因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。

  17. PCR及有关技术的发展历史（8） 九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 • 1998年 实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测 • 1999年 西方发达国家尝试将PCR应用于血液筛查

  18. PCR 循环 –第一步 –加热变性 靶序列 靶序列

  19. PCR 循环- 第二步 –引物与靶序列退火 靶序列 3’ 5’ 5’ 3’ Biotin Primer 1 Primer 2 Biotin 3’ 5’ 5’ 3’ 靶序列

  20. PCR 循环 - 第三步 - 引物延伸 靶序列 3’ 5’ 5’ 3’ Biotin Primer 1 Taq DNA Polymerase Primer 2 Biotin 3’ 5’ 5’ 3’ 靶序列

  21. 第1个 PCR 循环完成后 –得到两个拷贝的靶序列 靶序列 Biotin Biotin 靶序列

  22. 30次循环后靶序列扩增的数量 No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon

  23. PCR扩增过程图示

  24. PCR扩增的理论模式 PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达： Yn=Yn-1·(1+E) = Yn-2·(1+E)2=…= X·(1+E)n 0≤E≤1 其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。 等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.

  25. 影响PCR扩增效率的因素: PCR定量的困难? • 引物/靶的杂交 • 反应试剂的相对量 • 样本在扩增仪中的位置的不同 • 临床样本中DNA聚合酶抑制物的存在 • PCR扩增模板的量 • 靶核酸链的再退火及酶过量可致E降低

  26. PCR 和定量问题 • 高浓度/高效率 • 高浓度/低效率 • 低浓度/高效率 • N : 扩增分子的数目 • n : 扩增循环的次数 log-phase analysis end-point analysis N n

  27. 定量PCR与定性PCR测定的最根本的区别 定量PCR测定的测定点为PCR扩增的指数扩增期;而定性PCR测定的测定点则多为PCR扩增的平台期。

  28. 定性PCR测定方法 • 荧光PCR（ Taq Man和分子信标等） • PCR-膜上杂交 • PCR-ELISA

  29. 定量PCR的方法 • 定量PCR方法可归为三大类，即外标方法、动力学方法和内标共扩增方法 • 定量还可分为绝对定量（即测定X的分子数量）和相对定量（即测定不同样本中X的比率）

  30. 用外标准的定量PCR方法

  31. 使用外标的定量PCR方法的优缺点 • 优点：（1）方法简便，容易建立；（2）使用双孔重复测定，这种方法可得到非常准确的结果，甚至可排除管间的差异，但不能排除样本间的差异； • 缺点：（1）PCR反应体系中小的区别也会对测定造成较大的影响。由于最后在扩增效率上的差异，从而使得定量测定精密度和重复性不佳。 • 因此，如果建立一个使用外标准的PCR定量方法，则必须进行方法的精密度（批内变异）和重复性（批间变异）分析，以确定其应用的局限性。

  32. TaqMan实时荧光定量PCR

  33. 分子信标实时荧光定量PCR

  34. 动力学定量PCR方法 • 第一步：确定PCR扩增的效率； • 第二步：根据相应的公式计算原始模板数。

  35. 扩增效率的计算(1) • 如果在PCR每一个扩增循环中扩增效率为常数，则可通过在PCR扩增的指数期的数个连续的或非连续的周期中取扩增样本，然后测定每份样本中的产物Yn的量来测定E值。有必要收集2份以上的样本，最好是尽可能多的样本以确证扩增效率保持恒定；换句话说，也就是PCR尚未达到扩增效率开始降低时的阶段。如果取的是连续的样本，则可从公式（1）测得E值；

  36. 扩增效率的计算

  37. 扩增效率的计算(2) • 如果取的样本不连续，则可使用下述将公式（2）重排后得到的更为通用的公式，用参数j（取样中间隔的周期数）替代n，Yj（在较高循环周期数取样的产物量）替代Yn，Yi-j（在较低循环周期数取样的产物量）替代X： • E＝－1＋（Yi/Yi-j）1/j (3)

  38. X(原始模板数)的计算 一旦效率确定后，根据公式（4）可从测定的产物量和循环周期数计算得到X。公式（4）来源于公式（2）的重新排列： X＝Yn /(1＋E)n（4）

  39. X的另一种计算方式(1) 另一种方式是，根据公式（2）的对数形式，以所测定的Yn值的对数对函数n绘图得到X值： logYn = logX+ n×log(1+E) (5) 当n＝0时，可在图上读出X值，或通过对公式（5）的线性回归计算X值（图2）。

  40. 动力学方法的特点 这种方法的优点: (1)不需要外标准；（2）如果能测定PCR产物分子的绝对数量，则可得到待测样本的不同的扩增效率（Ee)。

  41. 使用非竞争性内标准的定量PCR方法 • 非竞争性内标准：（1）一般为与靶核酸无关的基因组；（2）既可是内源的也可是外源的；（3）与靶核酸无相同的引物结合位点和扩增序列。 • 对于DNA的扩增，非竞争性内标几乎所有的基因都可应用，最常用的有丙酮酸脱氢酶、前脑啡肽或β肌动蛋白的基因。 • 而对RNA的扩增，则非竞争性内标较难寻找。理想的mRNA内标应该在整个细胞周期中表达的水平变化不大，此外，其表达水平应接近于靶RNA，而且它们的扩增效率应相等，因此两者扩增线性区域是重合的。已有许多的mRNA被尝试用来作为此种内标，如HLA、β肌动蛋白、GPDH和组蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。

  42. 以非竞争性内标定量的主要优点 • 内标的制备简单 • 复管测定可排除管间差异，并且在一定程度上，可排除样本间的差异。

More Related