實驗動物操作技術

1. 實驗動物操作技術 實驗動物基礎技術概論 ( 一)

2. Outline • Animal restraint • Sexing • Animal identification • Drug administration • Injection • Bleeding • Clinical biochemistry Hematology • Estrus cycle • Drug extrapolation • Pathological necropsy • Common disease of Lab . Animals in Taiwan • Anesthesia • Surgery operation • Euthanasia

3. Animal Restraint • Rat • Mouse • Guinea pig • Rabbit

4. Rat 圖片來源；慈濟大學-實驗動物中心

5. Rat

6. Mouse • 以手指或平滑頭端的鉗抓住動物靠近尾巴基部。抓住和拉扯尾端會造成小鼠皮膚剝離。 • 經由頸後皮膚抓住動物。 • 假如抓取的皮膚離頭部太遠，小鼠便得以轉身來咬這個抓取處理小鼠的操作人員。 • 抓取小鼠必須緊抓但卻得溫和地握持著，如此小鼠便不會有困難呼吸的現象發生。 • 可使用塑膠保定裝置來固定小鼠以及其他囓齒類作為較長期時間的保定。

7. Guinea pig

8. Rabbit

9. Rabbit

10. Sexing • Male－Greater anogenital distance than females－Larger genital papilla (rat, mice)－Pointed genital papilla with a round opening (hamster)－Scrotal pouches lateral to the genital-anal line(GP)－A rounded, protruding penile sheath with a round urethral opening (rabbit) • Female－Shorter anogenital distance than males－Y shaped genital-anal opening (GP)－Elongated vulva with a slit opening (rabbit)－Conspicuous nipples

11. Sexing

12. Sexing

13. Animal Identification • Cage card • Tattooing • Ear tags • Ear punching • Implantable microchips-dog , cat • Toe clipping • Fur coloring-picric acid • Ring-chicken

14. Animal Identification • 打耳號(ear punch)：適用於動物標記、記錄用，以大鼠為例。準備材料：丟棄式橡皮手套、耳號器。步驟：1.固定大鼠。2.置耳號器於耳部。3.又快既準地打下，可避免耳號打得不完整。

15. 動　物　資　源　色　彩　記　號　系　統( Animal resources color code system ) 一般可用4種不同顏色的卡片標示出須特別注意的動物： 1. 紅色卡：標示生病動物當工作人員發現動物生病或需獸醫師注意的動物，則由工作人員填寫動物處理報告表，並放一張紅色卡在該籠記錄卡上，若情況危急則應立即告知動物健康技術員(AHT)或將表格交給動物健康技術員。若動物未受檢查，而紅色卡在24小時內移除的話，工作人員應填第二張處理表格，同時尋求動物健康技術員或獸醫師協助。 2. 黃色卡：標示須觀察的動物 　　當獸醫師已檢查過該動物，不須治療，但須密切注意的動物，則以黃色卡標示，動物健康技術員與工作人員須每天觀察這些動物，直到獸醫師判定動物已恢復健康，不再需要特別觀察才可將黃色卡移除。 3. 藍色卡：標示治療中的動物 　　直到獸醫師認為該動物不需再接受治療，才可移除。 4. 綠色卡：標示須犧牲的動物 　　動物將被工作人員犧牲掉之前，應以綠色卡標示，此外，應由研究人員或其代理人填妥"犧牲表格"交給動物健康技術員，或工作人員應通知動物健康技術員。

16. Drug administration • Solution diluted before injection－e.g. pentobarbital diluted with 0.9% saline • Smallest gauge needle as possible • Water soluble or not ? • Subcutaneous -scruff , neck • Intraperitoneal－gerbil , hamster and mouse , right caudal quadrant (left spleen)－rats, left caudal quadrant of abdomen Aspirate before injection • Aspirate before injection －Intramuscular －anterior aspect of the thigh －gluteal muscle of the hip －avoid the posterior thigh muscle (sciatic nerve)

17. Drug administration 肌肉注射(intramuscular injection)：以大鼠為例準備材料：丟棄式橡皮手套、注射筒(1C.C)、皮下注射針(22-30號)、注射藥劑、酒精棉、紗布。步驟：(1)以注射針筒吸取欲注射的藥劑。(2)固定大鼠。(3)以酒精棉擦拭欲注射部位。(4)注射針插入臀部肌肉。(5)試吸針筒以確定注射位置。如有血液倒流入針筒，表示不適當。重新插入。(6)慢慢地將液狀藥劑注入。避免注入太快，以防組織創傷。

18. Drug administration 皮下注射(subcutaneous injection)：以大鼠為例準備材料：注射筒(1-3C.C.)，其他與前面相同。步驟：(1)以注射針筒吸取欲注射的藥劑。(2)固定大鼠。(3)以酒精棉擦拭欲注射部位。(4)注射針插入拇指與食指擰起的皮膚交疊處(如頸部上方皮膚)。(5)試吸針筒以確定注射位置。如有血液，表示不適當的位置，重新插入。(6)慢慢地將液狀藥劑注入。

19. Drug administration 腹腔內注射(intraperitoneal injection)：準備材料：與前面相同。步驟：(1)~(3)步驟與前面相同。(4)注射針以30度角度插入腹部(左右邊)下方1/4處。(5)試吸針筒以確定注射位置。如有血液或其他液體，表示不適當的位置。重新插入。(6)慢慢地將液狀藥劑注入。

20. 腹腔內注射

21. 腹腔內注射

22. Drug administration 靜脈注射(intravenous injection)：大鼠靜脈注射一般部位有舌下靜脈、蹠骨背根靜脈、陰莖背根靜脈和外側尾靜脈等。以大鼠尾靜脈為例。準備材料：丟棄式橡皮手套、亞克力固定器、注射筒(1 C.C.)、注射針(25-30號)、注射藥劑、酒精棉、紗布。步驟：(1)固定大鼠。(2)酒精棉擦拭尾部。(3)插入的位置不靠近身體半尾長。(4)插入的注射針與靜脈平行。(5)注射針至少插入靜脈管內3公厘。(6)慢慢注入液狀藥液，避免使血管破裂。(7)確定止血後，再放回飼育盒。

23. Drug administration 經口投藥 • 經口投藥時，除可經飲水或飼料投予，也可以PO針投之。 • 在以PO針投藥時，應選用小鼠專用之PO針頭 ，，應使小鼠身體盡量拉長且頭頸要直，經口插入PO針時，方易通過喉頭而進入食道，並應估計針頭插入之深度，一般嚙齒動物的胃約在其胸骨末端之形如扇狀之劍狀軟骨處，故非常容易計算應插入之深度。

24. 經口投藥

26. Drug administration

27. Drug administration

28. Bleeding • Requiring anesthesia－Cardiac puncture－Jugular vein－Posterior vena cava－Ophthalmic venous plexus • Not requiring anesthesia － Lateral saphenous vein (GP) －Tail vein－Ear vein－Lateral saphenous vein－Toe tail cliping • Maximum amount of blood that can be safely removed for blood collection = 1% of body weight. Total blood volume is approximately 6% of body weight.-e.g. 5 kg rabbit X 1% = 50ml blood • Animal produce 0.75-1.0 ml / kg / day of blood-5 kg rabbit , 1 ml / kg = X ml / kg, X=5 ml / day-It will takes 10 days for the animals to replace the 50 ml that were withdrawn

29. BleedingMouse : Decision tree for blood sampling • Mice are considered to have around 58.5 ml of blood per kg of body weight. • How much have the total blood volume (TBV) in a 30g mouse? 58.5 ml/kg x 0.03 kg =1.755 ml.

30. BleedingMouse : Decision tree for blood sampling

31. Bleeding

32. Clinical Biochemistry Hematology • 梁鍾鼎，張明雄，洪昭竹，黃坤正。建立無特定病原大小鼠之血液化學參考值。中華獸醫誌25(1)：55-68, 1999。 • 梁鍾鼎，戴惠玉，趙俊炫，陳建宏。實驗動物臨床血液生化及血液學技術。八十八年度實驗動物疾病診斷技術訓練課程專輯，國科會國家實驗動物繁殖及研究中心編印，p.88-112, 1999。

33. Drug extrapolation

34. Pathological Necropsy • Necropsy guide: Rodents and Rabbit , Feldman DB, Seely JC, CRC Press, 1998, ISBN 0-8493-4934-6 • 陳憲全，梁鍾鼎，洪昭竹。小鼠常見疾病圖譜。行政院國科會國家實驗動物繁殖及研究中心編印，1996。 • 洪昭竹，梁鍾鼎。天竺鼠常見疾病圖譜。行政院國科會國家實驗動物繁殖及研究中心編印，1995。

35. Necropsy of the Rat • 1. Animal identification number. • 2. weight • 3. Sexing • 4. External examination • 5. Collect the eye and neighboring glands on the head. • 6. Collection the superficial mass. • 7. Collection the cervical LN, salivary glands, mammary glands, and preputional (clitorial) glands. • 8. Collection reproductive tracts urinary bladder. • 9. Collection the digestive organs. • 10.Collection the liver, kidney, and adrenal glands. • 11.Collection the sternum and rib. • 12.Examination of the oral cavity. • 13.Collection the rongue, thyroid glands, heart, and thoracic organs. • 14.Collection the brain, pituitary glands, and turbinate bones. • 15.Collection the sciatic nerve and adjacent muscle. • 16.Collection the proximal femur with bone marrow, the vertebral column and spinal cord.

36. 台灣常見囓齒類實驗動物疾病 • 徽漿菌( Mycoplasma pulmonis )感染 • 鼠肝炎病毒( Mouse Hepatitis Virus, MHV )感染 • 大小鼠蟯蟲( Pinworm infestation )寄生－ Syphacia muris－ Syphacia obvelata－ Aspicularis tetraptera • 恙蟲寄生( Myobia spp. )

38. Well done is better than well said (Benjamin Franklin) Just do it!!!

39. 實驗動物操作技術 實驗動物基礎技術概論 ( 二)

40. 實驗動物麻醉和基本技術 在實驗操作或手術的過程中為避免或減輕實驗動物的疼痛不適，必須給予止痛或麻醉。動物的麻醉需同時兼顧不影響實驗結果、實際臨床可執行的技術兩項考量。 • Analgesia：止痛，對疼痛失去敏感性。 • Tranquillization：精神安定，動物呈現一種行為改變狀態：精神與動作遲緩，鬆懈，對周圍環境的反應冷淡、對小疼痛常不在意。 • Sedation：鎮靜，輕微程度的中樞神經抑制狀態，保持醒覺，但安靜。 • Anesthesia：麻醉，以藥物或其他方式抑制動物局部(周邊性)或全體(中樞性)神經組織的活性，使動物部分或整個身體完全失去感覺作用。＊Local anesthesia：局部麻醉。＊General anesthesia：全身麻醉。完全無知覺與感覺(中樞性)。＊Surgical anesthesia：外科手術麻醉。完全無知覺與感覺，並有充分的肌肉鬆弛和痛感消失。

41. 實驗動物麻醉和基本技術 • 手術前詳細的計畫，瞭解實驗動物的解剖構造和生理學，操作人員的無菌觀念及技術，都是動物手術前需考慮的問題。一般來說首次進行動物手術時最好有獸醫師或動物技術人員在旁協助，以確認實驗的步驟、相關藥物和設備的使用。 • 實驗動物的手術可分為Survival和Nonsurvival兩類，前者指麻醉後或所有大小手術結束後動物還需生存著，後者指麻醉後或所有大小手術結束後既給與安樂死。進行Survival surgery時，不論是剖腹、截肢或注射藥物、處理傷口，皆需嚴格執行手術部位的剃毛消毒(beta-iodine scrub/alcohol)，材料滅菌(autoclave)及無菌操作(surgical glove＆aseptic operation)，視實驗需求動物可在術前注射抗生素以避免感染。如進行Nonsurvival surgery，雖不需Survival surgery般嚴格無菌操作，但至少要行操作部位的剃毛消毒和戴手套。

42. Principle of anesthesia • Balanced anesthesia • Impossible to develop a single anesthetic protocol to all animals • Extrapolate dosages must be careful e.g. morphine-rats and rabbits. CNS depression; but in mice and cat, tremors and convulsions • Strain, breed variation • Size, sex difference e.g. barbiturates: female rat > male ; mice vive versa • Temperament of animals e.g. vicious dog-more difficult to handle • Fat- as a repository for the anesthetic agents, prolonging the recovery • Age of animals- prolonged recovery, impaired renal or hepatic function • Physical condition- e.g. rats eating inadequate diets are resistant to barbiturates • Abnormal temperature and humidity- e.g. rats and rabbits are sensitive to anesthesia

43. Anesthesia-術前照顧 • FASTING???－It depends on－Dogs, cat, primate: 8-12 hours－Swine: 12-18 hours－Ruminants: 24-48 hours－Rabbit: 0-6 hours－In general, rodent and rabbit do not vomit, so it is unnecessary to withhold food and water.－Mice, should not be fasted for more than 3-4 hours.

44. Anesthesia-術前照顧 • 禁食期：犬、貓、豬、靈長類動物在麻醉前需禁食8-12小時(禁水6小時)，其他囓齒動物及兔子則不需。天竺鼠的唾液分泌較多，需多加注意。 • 健康狀態：麻醉或手術前最好能瞭解動物本身是否有潛在性疾病存在：如鼠類的黴漿菌感染，狗的心絲蟲感染。 • 緊急處理之概念：麻醉常出現呼吸、心跳停止現象，因此需準備常用急救藥物：Doxapram, Epinephrine, Dexamethasone...。

45. Anesthesia-麻醉前給藥 • 鎮靜劑(Tranquillizers/Sedatives)、止痛劑(Analgesics)、抗乙醯膽鹼(Anticholinergics)等藥品統稱為麻醉前給藥。 • 鎮靜劑及止痛劑可誘導麻醉平緩進行，降低(或直接跨越)麻醉興奮期的反應，間接可減少麻醉藥品使用量，降低麻醉死亡率。 • 抗乙醯膽類藥品可抑制迷走神經的興奮，避免手術期間嘔吐及過度流涎現象發生。

46. Anesthesia-麻醉前給藥 • Anticholinergics＊Atropine抑制呼吸道及唾液腺分泌物，防止心臟收到迷走神經的興奮所產的心跳徐緩。注意：已有心律不整的動物禁用。 • Tranquillizers ＆ Sedatives＊Phenothiazines：Chlorpromazine, Acepromazine, Promazine抑制腦幹及大腦皮質，產生安靜和減低運動性作用。注意：因血管擴張而易造成血壓降低，高劑量時會有肌肉僵直、震顫等現象。可與解離性麻醉劑(ketamine)共用來降低副作用。＊Butyrophenones： Droperidol, Fluanisone, Azaperone效果比Penothiazine強。注意：易造成血壓降低。＊Benzodiazepines：Diazepam (Valium), Midazolam控制及預防癲間，可使用於老年、肥胖動物，它可解除Ketamine引起之痙攣。注意：靜脈注射太快時會休克。皮下及肌肉注射效果不佳，且刺激性強。＊Alpha-2-adrenergic agonist tranquillizer：Xylazine (Rompun)常使用於貓科動物與靈長類，肌肉鬆弛效果佳。注意：刺激嘔吐中樞，會使90%貓嘔吐。適合與Ketamine合用。 • Narcotic analgesics (Opioids)＊Morphine, Pethidine, Buprenorphine, Methadone, Fentanyl屬管制藥品，精神性安定鎮痛作用。注意：低劑量會引起中樞神經抑制現象，較高劑量會產生興奮，超高劑量會引起中樞神經過度抑制而死亡。

47. Anesthesia-麻醉監控 麻醉可分為四期： • 第一期 無痛期：開始失去知覺。 • 第二期 興奮期：呼吸急促，狂亂或喊叫，對外界刺激異常反應。 • 第三期 手術麻醉期：分成四節，最適合進行手術。 • 第四期 休克死亡期：呼吸、心跳幾乎停止，1-5分鐘內可能死亡。 一般來說麻醉希望越快進入第三期(手術麻醉期)狀態，此期的第一、第二節足夠大部分手術所需。第三、第四節已是動物接近死亡的高危險期，此時必須暫停手術進行急救，否則一旦進入第四期休克期，動物80%以上會死亡。

48. Anesthesia-麻醉各期生理變化 註：不要將進入第二期興奮期的動物反應(狂亂喊叫、呼吸急促)，以及第三期第四節的腹式呼吸(腹壁的突然收縮)誤判為麻醉不足而追加藥量，導致動物死亡。

49. Anesthesia-麻醉各期生理變化 • 呼吸：＊囓齒類動物在麻醉過程中會出現停止呼吸數秒，然後又有一深呼吸，此為麻醉過度現象，須注意（尤其使用ketamine麻醉動物時）。＊一般而言胸式呼吸為輕度麻醉，麻醉越深，越接近腹式呼吸。＊不規則的呼吸表示動物快要甦醒或麻醉過深。 • 黏膜顏色：＊正常麻醉狀態下黏膜(口腔、肛門)為粉紅色，表示氧氣足夠；如呈現紫色，則為發疳(cyanosis)現象，表示缺氧。 • 微血管再充血時間(CRT)：＊手指壓牙齦後放開，牙齦再恢復正常粉紅色為止所需時間，正常要小於2秒，超過則顯示心臟輸出功能不佳。 • 脈膊：＊監測後腿股骨動脈，下顎動脈(大動物)，心跳數(囓齒類)。 • 反射：＊肛門反射及趾間痛覺反射皆可做為麻醉指標，口咽反射亦可做為使用氣體麻醉時恢復的指標。 • 眼反射：＊眼球震顫表示麻醉過淺。麻醉初期興奮時瞳孔放大，然後隨著麻醉程度加深而縮小；麻醉過量時瞳孔會極度擴大。

50. Anesthesia • 可分為局部麻醉和全身麻醉 • 局部麻醉較常使用於大型動物(如牛，馬) • 小型動物(鼠、兔、貓、狗)常使用全身麻醉 • 全身麻醉有注射性麻醉劑和吸入性麻醉劑兩類