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红细胞免疫检测及临床应用新进展. 锦州医学院附属第一医院 检验中心 张蕴丽. 一、红细胞免疫基本理论. （一）概述. 血液与免疫有密切联系。
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红细胞免疫检测及临床应用新进展 锦州医学院附属第一医院 检验中心 张蕴丽
（一）概述 • 血液与免疫有密切联系。 • 本世纪初，Landsteiner采用免疫学方法在人类红细胞与血液混合试验中发现了人类ABO血型系统。认识到红细胞表面存在许多能与血清中相应抗体凝集的抗原，如Mn，P型、Rn、Lutheran、Lewis、Kell、Duffy、Kidd等。除了目前所知数十种血型抗原外，红细胞还含有不少其它抗原，这些抗原在异常情况下，可引起对自身红细胞免疫应答产生抗体而导致红细胞系统疾病，如输血反应、新生儿溶血症、自身免疫溶血性贫血，药物过敏性红细胞溶血等。
我国在红细胞免疫研究工作始于1982年。 • 1989年成立全国红细胞免疫研究协作组。 • 1993年12月又成立了全国免疫学会基础免疫委员会红细胞免疫专业学组。
（二）红细胞免疫发展史 • 20世纪30年代，杜克（LH. Duke）首先发现锥虫在抗血清及补体存在时，可粘附于人类RBC上。 • Brown和Broom：不同人的RBC对锥虫的粘附能力高低不同。Brown本人的RBC对抗体调整过的锥虫一直未能显示任何反应，但Broom的RBC却有很强免疫粘附作用。因此他们比较了52例各种疾病患者与26例正常人的RBC粘附活性，发现两例TB病患者与1例风湿热患者粘附能力降低。
1956年：Nelson又将肺炎球菌注入猿猴体内，发现其绝大多数细菌粘附于RBC上，认为灵长类动物RBC的免疫粘附现象起到对血中异物的清除及细菌的固定作用，由此认为是宿主机体防御的一部分。1956年：Nelson又将肺炎球菌注入猿猴体内，发现其绝大多数细菌粘附于RBC上，认为灵长类动物RBC的免疫粘附现象起到对血中异物的清除及细菌的固定作用，由此认为是宿主机体防御的一部分。 • 1963年：尼雪俄考（K. Nishioka）证实红细胞这种免疫粘附现象是通过人红细胞膜C3受体来实现，现称C3受体为第一补体受体（Ccomplement Receptor Typel, CR1）。
70年代后期有关CR1的研究报道很多。 • 1980年弗尔龙（D.T.Teavon）从红细胞膜上分离出CR1，研究CR1的性质：分子量19万~25万，多态性膜糖蛋白，CR1总数95%以上存在于RBC膜上，CR1除了存在RBC膜上，还存在于多种细胞膜上如多核WBC、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、肥大细胞、肾小球上皮细胞。 • ECR1在RBC膜上呈簇状分布。
1981年美国生殖免疫学家西格尔（I.Sigel）在前人研究基础上发现1981年美国生殖免疫学家西格尔（I.Sigel）在前人研究基础上发现 • （1）RBC有多种免疫功能 • （2）RBC可粘附胸腺细胞 • （3）血清中存在红细胞免疫粘附抑制因子，预见了血清中存在红细胞免疫调节系统。 • （4）RBC膜过氧化物酶活性与CR1活性有关。 • （5）RBC有杀伤致病原的效应细胞样作用—推测RBC在阻止肿瘤细胞血行转移中有作用。 • 综上提出“红细胞免疫学说”。
1982年梅多夫（M, E, Medlf）体外证明RBC的CR1和血浆中Ⅰ因子共同作用将粘附的免疫复合物（Ic）中的C3b降介为C3dg，C3d而失去炎性。 • 1982年郭峰证明（体外）RBC可粘附补体调理过的酵母菌，并证明SLE，肿瘤患者红细胞免疫粘附酵母菌的能力低下，该实验证明RBC可直接粘附补体调理过的病原体。 • 1983年科娜康夫在猴血循环内注入免疫复合物（IC），用同位素示踪，发现大多数IC很快与红细胞结合，并迅速被运至肝、脾，在该特定环境下，巨噬细胞膜上FC段受体比RBC膜上CR1活性强，使IC从红细胞膜上脱落而被吞噬消毁——RBC促吞噬作用。
1984年西格费索（A.Sigfuson）通过体外美州商陆素刺激淋巴细胞转化实验发现加入自身RBC可增加淋巴细胞转化率和培养液中IgG、IgA量。1984年西格费索（A.Sigfuson）通过体外美州商陆素刺激淋巴细胞转化实验发现加入自身RBC可增加淋巴细胞转化率和培养液中IgG、IgA量。 • 1985福斯里德（J.Forslid）在体外通过对比实验证明红细胞促吞噬作用与红细胞CR1和SOD酶活性有关。 • 1986年郭峰通过体外对比实验证明RBC可粘附补体调整的各种肿瘤细胞，并证明肿瘤患者RBC免疫粘附肿瘤细胞的下降，发现RBC可直接粘附未经补体调理过的肿瘤细胞，其机理不明。
1992年刘景田等证实这种直接免疫粘附的机理与红细胞膜上CR1和肿瘤细胞膜上C3b分子有关，肿瘤细胞膜上的补体来源于荷瘤小鼠的腹水中，而荷瘤小鼠的腹水中确有少量补体物质的存在。1992年刘景田等证实这种直接免疫粘附的机理与红细胞膜上CR1和肿瘤细胞膜上C3b分子有关，肿瘤细胞膜上的补体来源于荷瘤小鼠的腹水中，而荷瘤小鼠的腹水中确有少量补体物质的存在。 • 1986年凯斯（L.Keyes）等发现人自身红细胞可增加T细胞产生γ-干扰素。 • 1987年鲁杰利斯（M.T.Rugeles）发现自身红细胞加入外周血单个核细胞培养管中可增强原发性和继发性特异抗体应答。 • 1987年郭峰通过体外对比实验证明血清中还存在一种加热（58℃30'）不灭活的红细胞免疫粘附促进因子。
1988年威瑞拉（Vireal）用单抗标记法证明红细胞膜有CR3。1988年威瑞拉（Vireal）用单抗标记法证明红细胞膜有CR3。 • 1989年郭峰发现RBC和淋巴细胞或粒细胞可共同围攻粘附各种肿瘤细胞。 • 1990年派考德（J.P.paceand）采用折痕—标记免疫电镜比较PMN和红细胞的CR1形态，发现细胞细胞上几乎50%的CR1量＞3单位簇状分布，而这种簇状分布在PMN不到15%。CR1的这种簇状分布可使它与C3包被的IC结合位点呈多价性，连接更为牢固。 • 1994年刘景田发现CR1免疫调节因子，其中包括CR1免疫调节促进因子和CR免疫调节抑制因子。对粒细胞、淋巴细胞（主要指B淋巴细胞）也有同样的调节作用。
（三）红细胞的免疫物质 • 免疫细胞的免疫功能是通过其免疫物质实现的，红细胞的免疫物质主要为存在于红细胞膜上的蛋白质分子。现已发现红细胞有许多与免疫有关的物质如CR1、CR3、CD58、CD59、DAF，SOD酶等。
免疫 细胞 红细胞 T细胞 B细胞 NK细胞 K细胞 巨噬细胞 中性 粒细胞 细胞数/ML 5.4×109 2×106 0.5×106 0.3×106 3.66×106 IgGFC受体 － ± ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ CR1 ＋ － ＋ － ＋ ＋ ＋ 免疫粘附 ＋ － － － － ＋ ＋ 免疫功能 粘附提呈 抗原等 细胞 免疫 体液 免疫 细胞 免疫 细胞免疫 处理提 呈抗原 调理吞噬 • 红细胞与其它免疫细胞的比较
1．补体受体（CR1，CR3） • 补体受体存在于不同种类的血细胞上，不同的血细胞所具有的补体受体不同，补体受体根据结合补体C3片段种类的不同可分为CR1，CR2、CR3三类。 • CR1是C3b、C4b的受体也是与红细胞免疫粘附作用有关受体。 • CR2是C3d的受体，C3d是C3b裂解的终末产物。 • CR3是iC3b的受体（是C3b受I因子，H因子在CR1参与作用下形成的无活性C3b（iC3b）
红细胞的补体受体主要是CR1，最近发现还有CR3 • ①CR1是一种单肽链糖蛋白，具有明显的多肽性，有4个同种异型，其配体是C3b、iC3b、C4b、iC4b均可结合于CR1，但C3b仅需少量即可发生免疫粘附（约60个分子/细胞），而C4b则需较大数量（＞2500个分子/细胞），才能发生反应。 • iC3b也可结合于CR1，但结合程度较轻，它与CR3型受体结合能力强。 • ②CR1活性能被胰酶、糜蛋白酶、鞣酸、甲醛、强酸、强碱所破坏，在PH6.7~7.3下最能发挥其细胞免疫粘附作用。
③血细胞中CR1数量：红细胞CR1与白细胞CR1数比例21：1，红细胞膜上的CR1呈簇状分布，在吞噬细胞上主要呈散在分布，每簇约含2-15个CR1，红细胞CR1总数与簇数和每簇中CR1单体数高度相关。③血细胞中CR1数量：红细胞CR1与白细胞CR1数比例21：1，红细胞膜上的CR1呈簇状分布，在吞噬细胞上主要呈散在分布，每簇约含2-15个CR1，红细胞CR1总数与簇数和每簇中CR1单体数高度相关。 • ④CR1簇状分布优点：可使它与C3b包被的IC结合位点呈多价性，连接更为牢固。 • ⑤红细胞膜上的CR1总数比白细胞多。 • ⑥红细胞对粘附C3b分子的抗原（如肿瘤细胞、细菌等）的亲和力显著大于吞噬细胞，红细胞在清除CIC致热原中占有重要地位。CR3：可能具备对某些小抗原有吞噬，通过释放过氧化酶对抗原加以消毁和可直接识别某些细菌有关。
2．淋巴细胞功能相关抗原-3（LFA-3） • 为红细胞膜上的一种蛋白分子，是CD2的天然配体，广泛分布于红细胞、T淋巴细胞，B淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞，血小板等表面是由14KD和19KD二条单链多肽和糖基组成的糖蛋白，分子量为55-70KD。 • CD2为T细胞分化抗原中最早出现的，胸腺细胞时即出现，相当于OKT系统中OKT11，CD4（即辅助T细胞）CD8（抑制T细胞）细胞均存在此一分化抗原。
LFA-3作用：LFA-3与受体CD2结合后可传递足以诱导T细胞增殖，淋巴因子分泌及非MHC限制性细胞毒作用的跨膜信号，使T细胞活化，分泌IL-2，IFN-r和表达IL-2受体等，另外CD2/LFA-3在胸腺发生及T、B细胞相互作用中均起作用。LFA-3作用：LFA-3与受体CD2结合后可传递足以诱导T细胞增殖，淋巴因子分泌及非MHC限制性细胞毒作用的跨膜信号，使T细胞活化，分泌IL-2，IFN-r和表达IL-2受体等，另外CD2/LFA-3在胸腺发生及T、B细胞相互作用中均起作用。 • 因此，LFA-3与CD2作用是免疫细胞间相互协调作用，淋巴细胞活化，产生淋巴因子的分子基础。
3．人类补体膜辅助因子蛋白（MCP） • 是红细胞膜上功能蛋白的一种，能与CR1，DAF等基因协调完成红细胞对补体活性的调节，是灭活C3b、C4b、iC3b的细胞表面辅助因子，可保护自身细胞免疫补体损伤。 • 4．降介加速因子（DAF） • 亦称为补体衰变加速因子，是一种糖蛋白，不同细胞膜上DAF分子量不同。DAF与红细胞膜上MCP、CR1等多种功能蛋白共同协调完成红细胞对补体活性的调节，使宿主细胞免受自身补体级联放大过程中引起的损伤。DAF主要作用于Bb及C2a，而CR1主要作用于C3b片段，DAF结合C3b的能力比CR1小得多。
5．I因子 • 即C3b灭活因子，是一种糖蛋白。作用增加吞噬细胞对抗原的粘附，从而增强其免疫功能。与NK/K细胞上的CR3结合，发挥依赖补体的细胞毒作用（CDCC），杀灭肿瘤细胞或其它异已细胞。 • 6．过氧化物酶 • 在RBC免疫粘附后该酶活性增强，提高消毁抗原物质的能力，且可将抗原决定簇提呈给T细胞，通过T细胞表面受体（TCR）激活T细胞功能。
7．过氧化物歧化酶 • RBC内含有SOD（超氧化物歧化酶），该酶是一类重要的氧自由基清除酶，使O2（超氧化物阴离子自由基）变为H2O2，O2分子，通过清除氧自由基O2，使细胞和组织免受损害，保护和增强免疫细胞的免疫功能。 • 8．红细胞免疫粘附抑制因子 • 存在血清中，1981年发现一种糖蛋白。主要抑制红细胞C3b受体活性，可降低红细胞粘附携带IC的能力。 • 9．红细胞免疫粘附促进因子 • 也存在于血清中，为一种糖蛋白，提高红细胞C3b受体活性，故可使红细胞免疫粘附活性增强。
（三）红细胞的免疫功能 • 1．红细胞免疫粘附、携带及清除抗原异物的功能 • 免疫粘附：指细菌、寄生虫、梅毒螺旋体、胸腺细胞、肿瘤细胞等抗原物质激活补体或这些抗原与相应的抗体结合激活补体形成复合物粘附于血细胞（红细胞、白细胞或血小板）上。 • 红细胞的免疫粘附作用：通过细胞膜表面的补体受体实现的。
抗原与抗体形成的Ab-Ab复合物（或Ag-Ab-C）形成存在，红细胞通过其膜上CR1、CR3的免疫粘附功能将Ag异物携带至肝脾加以消毁的，因此红细胞是机体清除循环系统液相中CIC的主要承担者，几乎所有的补体调理过的抗原和IC都是由红细胞结合运至肝脾消毁的。抗原与抗体形成的Ab-Ab复合物（或Ag-Ab-C）形成存在，红细胞通过其膜上CR1、CR3的免疫粘附功能将Ag异物携带至肝脾加以消毁的，因此红细胞是机体清除循环系统液相中CIC的主要承担者，几乎所有的补体调理过的抗原和IC都是由红细胞结合运至肝脾消毁的。
在肝脾血流降速时，RBC与固定巨噬细胞比例剧降为10:1—5:1时，吞噬细胞上CR1、CR3、FCR对红细胞上IC中的C3b、iC3b总亲和力大于红细胞CR1的亲和力时，微循环中的Ag-Ab-C复合物才能从RBC转向巨噬细胞，巨噬细胞便将红细胞免疫粘附的复合物夺下，并将其免疫粘附吞噬，红细胞释放回血液循系统，不被吞噬，继续执行CIC的功能。但对那些结合有特异性抗原、抗体、补体复合物的RBC被吞噬细胞吞噬、清除血行中大量潜在的致病性免疫复合物。在肝脾血流降速时，RBC与固定巨噬细胞比例剧降为10:1—5:1时，吞噬细胞上CR1、CR3、FCR对红细胞上IC中的C3b、iC3b总亲和力大于红细胞CR1的亲和力时，微循环中的Ag-Ab-C复合物才能从RBC转向巨噬细胞，巨噬细胞便将红细胞免疫粘附的复合物夺下，并将其免疫粘附吞噬，红细胞释放回血液循系统，不被吞噬，继续执行CIC的功能。但对那些结合有特异性抗原、抗体、补体复合物的RBC被吞噬细胞吞噬、清除血行中大量潜在的致病性免疫复合物。
RBC通过清除血循环中的抗原异物，如细菌、病毒、癌变细胞等，在防御微生物感染，保持机体内环境的平衡，维持自稳机能方面有着重要意义。
2．红细胞识别和储存抗原的功能 • Garrey用新生兔做动物实验，将标记氚的牛血清白蛋白（3H-BSA）注入新生家兔腹内，用外周血涂片及组织切片的放射显影法观察循环中RBC和肝血管内的RBC，发现6小时后血循环中出现携带BSA的红细胞，12h后绝大部分抗原浓集于肝脏血管内，注入1-2天，肝血管系统内外红细胞表面聚集了大量抗原，携带抗原的红细胞在肝、血循环中可持续4-6周以上。
该实验结果提示新生兔的RBC有识别和储存异种抗原物质的能力。同时将标记氚的兔血清白蛋白（3H-BSA）抗原，采用同样方法观察，表明新生兔RBC对同种抗原亦具有识别能力和免疫耐受性。该实验结果提示新生兔的RBC有识别和储存异种抗原物质的能力。同时将标记氚的兔血清白蛋白（3H-BSA）抗原，采用同样方法观察，表明新生兔RBC对同种抗原亦具有识别能力和免疫耐受性。 • 郭峰报道RBC可粘附血清调理过的酵母菌和各种肿瘤细胞。机理可认为酵母菌和肿瘤细胞可旁路激活补体粘附C3b，再与RBC上的CR1相结合而被识别。由此认为RBC能识别，储存各种抗原。
3．红细胞具有效应细胞样作用 • RBC膜表面存在过氧化物酶活性，是一种典型溶酶体酶，抗原粘附RBC可提高粘附区域过氧化物酶活性，使RBC作为效应细胞起作用，RBC通过这种酶激活的作用，可直接杀伤病原体，消毁粘附的抗原抗体复合物，加强CIC的清除。因此认为RBC本身也有防御感染的作用。
4．红细胞具有抗原提呈细胞（APC）样作用 • RBC具有双重粘附特性，既可粘附IC，又可粘附自身胸腺细胞及T细胞上，从而可以将抗原提呈给胸腺细胞及T细胞，起抗原提呈细胞（APC）样作用，增强T细胞免疫功能，更有效地清除IC。
5．红细胞促进淋巴细胞的免疫功能 • RBC具有促进T、B淋巴细胞和体液免疫功能，扩大细胞免疫及体液免疫效应。RBC具有双重免疫粘附特性，即RBC不仅与Ag-Ab-C互相粘连，且可与自体的胸腺淋巴细胞和T淋巴细胞粘附，形成自身玫瑰花结，这种双重免疫粘附，在IC与T淋巴细胞之间起着桥梁作用，使抗原与T淋巴细胞靠近，从而将抗原提呈给T淋巴细胞，增加T淋巴细胞捕捉抗原的机会，从而扩大T细胞依赖的免疫应答。
T淋巴细胞在RBC作用下，能促使IL-2受体表达及γ-干扰素产生，抗CD2单克隆抗体可抑制RBC对T细胞产生干扰素的促进作用。T淋巴细胞在RBC作用下，能促使IL-2受体表达及γ-干扰素产生，抗CD2单克隆抗体可抑制RBC对T细胞产生干扰素的促进作用。 • 红细胞IFA-3与T细胞CD2的作用在促进T淋巴细胞活化及产生淋巴因子的分子基础。红细胞通过LAF-3/CD2以及CR1-CIC/TCR对T细胞粘附，提呈抗原，激活T细胞增殖而起抗原提呈细胞作用。红细胞能促进B细胞增殖分化产生抗体和加强抗体依赖的细胞毒性（ADCC）作用。
红细胞还能增强淋巴细胞对肿瘤细胞的免疫粘附作用，直接增强NK细胞的抗肿瘤活性，且红细胞增强NK细胞依赖于Ca2+的存在。红细胞还能增强淋巴细胞对肿瘤细胞的免疫粘附作用，直接增强NK细胞的抗肿瘤活性，且红细胞增强NK细胞依赖于Ca2+的存在。 • 红细胞能显著增加LAK细胞（Lyhphokime cativctell killed cell）对肿瘤细胞的杀伤作用。在培养瓶内加入RBC可促进LAK细胞的产量和活性，RBC数与淋巴细胞数为100:1时IL-2激活的LAK细胞活力最大。LAK细胞系淋巴因子激活的杀伤性淋巴细胞，对多种肿瘤细胞均有杀伤作用，是目前肿瘤过继疗法中一各很有前途的细胞。
因此，RBC对T、B淋巴细胞、NK、LAK细胞等的免疫功能有着重要的影响。而白细胞分泌的细胞因子（如胸腺素、IL-2、IFN-γ等）可促进红细胞的免疫功能。因此，RBC对T、B淋巴细胞、NK、LAK细胞等的免疫功能有着重要的影响。而白细胞分泌的细胞因子（如胸腺素、IL-2、IFN-γ等）可促进红细胞的免疫功能。
6．红细胞促进吞噬细胞的吞噬功能 • RBC通过其表面的CR1（补体受体）与病原体与相应抗体组成IC的连接，可促进吞噬细胞对微生物的吞噬作用。且与红细胞表面的补体受体CR1数量与活性有关。 • Siegel推测RBC可阻止癌细胞在血循环中扩散。癌细胞可粘附红细胞，易被吞噬细胞捕捉、吞噬、清除，防止癌细胞的扩散。红细胞具有增强吞噬细胞抗肿瘤作用。
7．红细胞清除阴离子的作用 • 超氧阴离子（O2）是生物体内主要的自由基（FR），在许多情况下，对机体是有害的，是导致炎症、衰老及癌变等的原因之一。红细胞超氧化物歧化酶（SOD）是一类重要的氧自由基清除酶，具有抗炎、抗衰及抗辐射的作用，可消除微环境中超氧化物阴离子自由基对巨噬细胞膜和淋巴细胞的破坏作用，以保护和增强吞噬功能和淋巴细胞的免疫功能，使吞噬细胞产生IL-1、TNF等因子的能力增强。SOD可清除微环境中的氧自由基对LAR活性的抑制，提高LAK细胞的产量与活性。
8．红细胞参与补体活性的调控 • 补体系统通过免疫细胞上补体受体在调节细胞和体液免疫中处于枢纽地位。其中C3b分子占据重要地位。而红细胞有CR1、I因子、DAF与血浆H因子协同，先将C3b固定，后降解为iC3b、C3b，C3dg，使细菌、肿瘤细胞打上标记，使其更易被相应补体受体T、B淋巴细胞、NK、LAK细胞，吞噬细胞所识别，补体系统经红细胞协调作用调控各免疫细胞的免疫反应。
9．红细胞自身免疫调控系统 • 血清中存在红细胞免疫粘附抑制因子和促进因子，分别抑制和促进红细胞免疫粘附活性，正常情况下这一对调节因子处于动态平衡。当比例失调，红细胞免疫功能低下或紊乱。
二、红细胞免疫学实验技术 • 目前国内外测定RBC免疫功能的方法有：花环法、放免法、酶联法、红细胞培养技术，发光法。 • 郭峰将红细胞免疫调节功能测定方法的研究概括为三个测定：
（1）红细胞免疫粘附功能的测定，包括： • RBC-C3b受体花环 • RBC-IC花环 • 红细胞SPA混合花环 • 肿瘤RBC花环[直向肿瘤红细胞花环率（DTER）、促肿瘤红细胞花环率（ETER）、自然肿瘤红细胞花环率（NTER）] • 抗IgG单克隆抗体Coomb's试验
（2）红细胞免疫功能自身调控能力的测定。包括：（2）红细胞免疫功能自身调控能力的测定。包括： • 血清中红细胞免疫粘附抑制因子测定 • 血清中红细胞免疫粘附促进因子测定
（3）红细胞对其它免疫细胞的免疫调控能力的测定（3）红细胞对其它免疫细胞的免疫调控能力的测定 • 红细胞促淋巴细胞吞噬功能的形态学方法 • 肿瘤红细胞淋巴细胞混合花环 • 肿瘤红细胞粒细胞混合花环
近年来，红细胞免疫测定法的研究有了新的进展，如：近年来，红细胞免疫测定法的研究有了新的进展，如： • 自然肿瘤红细胞花环试验，补体致敏酵母多糖血凝法，肿瘤细胞血凝法，红细胞促吞噬功能发光技术，红细胞免疫粘附混合花环试验，红细胞CR1PCR技术，红细胞促NK细胞活性测定技术等。
（一）红细胞C3b受体花环及免疫复合物花环试验（一）红细胞C3b受体花环及免疫复合物花环试验 • 1．原理： • 红细胞C3b受体花环：红细胞膜上CR1可与C3b致敏酵母多糖粘附形成花环，花环率的高低与CR1的活性及数量有关；RBC免疫复合物（IC）花环：RBC膜粘附的IC中C3b分子可与酵母多糖粘附形成花环，花环率的高低与血清中CIC的含量有关。
