Figura 7.56 Cariossidi di mais pigmentale ( wild-type), non pigmentale (colorless)

1. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI QUADRO 7.3 – BARBARA MCCLINTOCK E GLI ELEMENTI GENETICI MOBILI (TRASPOSONI) Figura 7.56 Cariossidi di mais pigmentale (wild-type), non pigmentale (colorless) e pigmentate a settori (spotted) risultanti dalla trasposizione di elementi genetici mobili.

2. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI Figura 7.57a,b Meccanismi di trasposizione: (A) trasposizione conservativa; (B) trasposizione replicativa (da: R.J. Brooker 1999, modificata).‏

3. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI Figura 7.57c Meccanismi di trasposizione: retrotrasposizione (da: R.J. Brooker 1999, modificata)‏

4. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI Figura 7.58 Struttura e trasposizione di un elemento trasponibile: l'enzima trasposasi riconosce le sequenze ripetute invertite che fiancheggiano l'elemento trasponibile, forma una struttura ad anello inducendo l'escissione dell'elemento stesso che in seguito può reinserirsi in un diverso sito genomico (da: B.B. Bunhanan et al. 2000, modificata).

5. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI Figura 7.59 Struttura e trasposizione di un retrotrasposone: l'enzima trascrittasi inversa produce una copia di DNA usando come stampo un RNA intermedio (da: B.B. Buchanan et al. 2000, modificata).

6. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI ELEMENTI DI CONTROLLO Ac/Ds DI MAIS: PRIMO ESEMPIO DI ELEMENTI TRASPONIBILI DESCRITTO PER GLI EUCARIOTI Figura 7.60 Modello di rottura-fusione-ponte in una coppia di cromosomi (da: B.B. Buchanan et al. 2000, modificata).

7. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI ELEMENTI DI CONTROLLO Ac/Ds DI MAIS: PRIMO ESEMPIO DI ELEMENTI TRASPONIBILI DESCRITTO PER GLI EUCARIOTI Figura 7.61a Sistema Ac/Ds di mais: effetti della trasposizione sul colore delle cariossidi.

8. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI ELEMENTI DI CONTROLLO Ac/Ds DI MAIS: PRIMO ESEMPIO DI ELEMENTI TRASPONIBILI DESCRITTO PER GLI EUCARIOTI Figura 7.61b Trasposizione dell'elemento Ds al locus C in presenza di Ac in mais (l'endosperma di una cariosside è triploide, in quanto deriva da due nuclei aploidi materni e da un nucleo aploide paterno)(Ds+ e Ac+ indicano l'assenza di tali elementi).

9. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI ELEMENTI DI CONTROLLO Ac/Ds DI MAIS: PRIMO ESEMPIO DI ELEMENTI TRASPONIBILI DESCRITTO PER GLI EUCARIOTI Figura 7.62 Quadro sinottico dei principali effetti degli elementi di controllo, con riferimento al sistema Ac/Ds (da: A.J.F. Griffiths et al. 1999, modificato).

10. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI ELEMENTI DI CONTROLLO Ac/Ds DI MAIS: PRIMO ESEMPIO DI ELEMENTI TRASPONIBILI DESCRITTO PER GLI EUCARIOTI Figura 7.63 Rilevazione di una rottura (fonte di instabilità)‏ cromosomica dovuta all'azione dell'elemento Ds in mais mediante analisi cariologica e genetica (da: A.J.F. Griffiths et al. 1999, modificata).

11. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI ELEMENTI DI CONTROLLO Ac/Ds DI MAIS: PRIMO ESEMPIO DI ELEMENTI TRASPONIBILI DESCRITTO PER GLI EUCARIOTI Figura 7.64 Elementi del sistema Ac/Ds: struttura di Ac e dei membri Ds.

12. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI ELEMENTI DI CONTROLLO Ac/Ds DI MAIS: PRIMO ESEMPIO DI ELEMENTI TRASPONIBILI DESCRITTO PER GLI EUCARIOTI Tabella 7.14 Trasposoni endogeni caratterizzati nelle specie vegetali.

13. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI ELEMENTI DI CONTROLLO Ac/Ds DI MAIS: PRIMO ESEMPIO DI ELEMENTI TRASPONIBILI DESCRITTO PER GLI EUCARIOTI Tabella 7.15 Trasposoni funzionanti in sistemi eterologhi.

14. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI STRATEGIE DI MARCATURA TRASPOSONICA Figura 7.65a Strategie di marcatura trasposonica: approccio mirato.

15. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI STRATEGIE DI MARCATURA TRASPOSONICA Figura 7.65b Strategie di marcatura trasposonica: approccio casuale.

16. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI RETROTRASPOSONI Figura 7.66 Meccanismo di funzionamento dei retrotrasposoni (da: R.J. Brooker 1999, modificata).

17. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI RETROTRASPOSONI Figura 7.67 Rappresentazione schematica di un retrotrasposone o retroelemento virus-simile.

18. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI RETROTRASPOSONI ELEMENTI Ty DI LIEVITO Figura 7.68 Struttura di un elemento trasponibile di lievito (Ty1).

19. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI RETROTRASPOSONI ELEMENTI COPIA-SIMILI, ELEMENTI GYPSY, ELEMENTI FB ED ELEMENTI P DI DROSOPHILA Figura 7.69a,b Rappresentazione schematica della struttura degli elementi copia-simili (A), FB (B)‏ (da: A.J.F. Griffiths et al. 1999, modificata).

20. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI RETROTRASPOSONI ELEMENTI COPIA-SIMILI, ELEMENTI GYPSY, ELEMENTI FB ED ELEMENTI P DI DROSOPHILA Figura 7.69c Rappresentazione schematica della struttura degli elementi P (da: A.J.F. Griffiths et al. 1999, modificata).

21. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI RETROTRASPOSONI RETROVIRUS, RETROGENI O RETROPOSONI Figura 7.70 Ciclo vitale di un tipico retrovirus (da: A.J.F. Griffiths et al. 1999, modificata).

22. 7.13 ELEMENTI GENETICI MOBILI O ELEMENTI TRASPONIBILI TRASPOSONI DI PROCARIOTI Tabella 7.16 Principali tipi di trasposoni procariotici ed aucariotici.

23. GENETICA FORWARD E REVERSE Obiettivo: assegnare una funzione ad ogni gene principali strategie sistematiche per risalire alla funzione di un gene nelle piante. Sebbene molte delle tecniche descritte sono utilizzate esclusivamente in ambito vegetale, le strategie generali possono essere generalizzate anche ad altri sistemi. Il metodo classico per determinare la funzione di un gene si basa sulla ricerca e interpretazione di mutazioni in quel gene. Questo metodo si basa sulla mutagenesi sistematica delle sequenze geniche e produce collezioni di mutazioni (prevalentemente recessive) di tipo “loss of function”. La caratterizzazione genetica e funzionale di queste mutazioni riesce, in molti casi, ad assegnare una funzione al gene in analisi. A partire da questa informazione si risale alla sequenza genica, utilizzando varie tecniche di clonaggio. Questo approccio che parte dalla funzione per risalire al gene è noto come genetica diretta(forward genetics).

24. La grande disponibilità di sequenze geniche conseguenti alla diffusione delle tecniche di sequenziamento del DNA e, specialmente, i grandi progetti di sequenziamento genomici, hanno rivoluzionato l’approccio alla determinazione della funzione di un gene. Frequentemente oggi si fa il percorso contrario; si parte da una sequenza genica ben caratterizzata e si risale alla sua funzione. Per esempio è possibile generare piante transgeniche ed esprimere il gene in versione senso o antisenso, per studiarne il fenotipo e, da questo, cercare di dedurre la funzione del gene. Formalmente questo significa generare mutazioni (dominanti) di tipo “gain of function” Allo stesso scopo, ma in maniera più sistematica, è possibile analizzare apposite librerie di mutanti per identificare tutti i mutanti di un gene d’interesse e conoscerne i fenotipi mutanti. Questo approccio che parte dal gene per risalire alla funzione è nota come genetica inversa(reverse genetics).

25. Fenotipo??? Fenotipo FORWARD mutante T-DNA Gene REVERSE PCR-screening Funzione??? Funzione Gene

26. Aumento espressione del gene endogeno: • forte costitutiva • ectopica • inducibile • Riduzione/silenziamento del gene endogeno: • AntiSENSO • RNAi • co-soppressione, Strategie molecolari per studiare la funzione di un gene nelle piante • Knock Out del gene..... • genetica forward • genetica reverse

27. Strategie genetiche per studiare la funzione genica Inattivazione di un gene per identificare e caratterizzare un fenotipo Non tutti i geni sono “mutagenizzabili” perché: • geni funzionalmente ridondanti • (geni a funzione simile ma non omologhi) • (ridondanza strutturale v/s ridondanza funzionale) • geni coivolti in diverse fasi dello sviluppo, e mutazioni in tali geni possono causare fenotipi letali o pleiotropici

28. Knock Out del gene..... mutagenesi sito-specifica v/s mutagenesi inserzionale “random” Nelle piante No mutagenesi sito-specifica!!!!! Quindi............ mutagenesi inserzionale “random”

29. Strategie di Mutagenesi Inserzionale • a) T-DNA • mutageno inserzionale che produce inserzioni stabili • no “hot spots” di integrazione • b) Trasposoni • il trasposone può essere exciso dal gene inattivato • (reversione del fenotipo = complementazione) • eventi di trasposizione avvengono in zone limitrofe al sito di inserzione

30. Transposon tagging • Il sistema Ac/Ds (agente in trans) • Elementi Ac: (4563 bp) codificano per una trasposasi • ElementiDs: corrispondono ad elementi Ac deleti della trasposasi • Caratteristiche del sistema Ac/Ds in mais: • contiene delle IR di 11-bp alle estremità, essenziali • codifica per una proteina di 92kDa con attività di trasposasi • 101 aa N-ter non necessari per la trasposizione • circa 200 bp ad ogni estremità sono necessari per la trasposizione • la trasposasi lega un esamero AAACGG • dopo trasposizione vengono generati dei DR di 8-bp • altri residui di DNA vengono lasciati a seguito della trasposizione • gli elementi DS sono deleti o della trasposasi o delle IRs

31. Transposon tagging • Barbara Mc Clintock è stato il 1°scienziato a predire che i trasposoni, elementi genetici mobili, erano presenti nei genomi eucariotici. Lei ha isolato il sistema Ac/Ds da mais. • Il sistema Ac/Ds è stato utilizzato in Arabidopsis x generare collezioni di mutanti. La bassa attività dell’elemento Ac, è stata aumentata usando la trasposasi sotto il 35S. Cmq la frequenza di reinserzione dell’elemento Ac è relativamente bassa. Ciò puo’ anche dipendere da successive trasposizioni dell’elemento, dovuto a mancato controllo dell’attività di trasposizione. Un’alternativa a ciò è l’uso della trasposasi sotto controllo di un promotore HS. • Elementi trasponibili isolati da mais e Antirrhinum sono utilizzati in altre specie nelle quali risultano assolutamente attivi.

32. Vantaggi del Transposon Tagging • Evitare mutazioni indesiderate (dovute all’evento di trasformazione).Cosi la mutagenesi è separata dalla trasformazione perchè la trasposasi ed il trasposone/T-DNA (Ds)sono trasformati in 2 diverse piante. La trasposizione avviene solo in seguito all’incrocio tra le due linee. • Ottenere mutazioni stabili che possono revertire. Una mutazione causata da un trasposone inerte è stabile finchè il trasposone non è mobilizzato da una trasposasi, in seguito a reincrocio. Quando il trasposone salta lascia il “footprint”, ma il fenotipo PUO’ comunque revertire. • Ottenere nuove mutazioni. Quando il trasposone salta e lascia il “footprint” questo può causare una nuova mutazione (frameshift, inserzioni aminoacidiche) • “Taggare” il gene d’interesse x inserzione. I trasposoni di tipo Ac fanno trasposizioni “short-range”. Identificando una linea con trasposone inerte che mappa vicino al gene d’interesse, si mobilizza il trasposone x incrocio con la trasposasi e si seleziona il “salto” nel gene.

33. T-DNA tagging • Inserzione del T-DNA nel genoma vegetale mediante una “illegitimate recombination” • No hot spots di integrazione • Distribuzione random sui 5 cromosomi di Arabidopsis • Produzione di >18000 FSTs (Flanking Sequence Tags) x analisi dei T-DNA IS • RISULTATI • 40% delle integrazioni sono in geni • Nessuna categoria di geni è particolare bersaglio di integrazione • FSTs più frequenti negli introni che negli esoni (43FSTs/Mb v/s 33FSTs/Mb) • LB spesso integrato full-length, mentre RB risulta spesso troncata • Coinvolgimento di “microsimilarità” tra LB e la sequenza vegetale preIS • Integrazione influenzata anche dalla composizione nucleotidica • Preferenza per regioni T-rich (i.e. promotori e introni)

34. Mutagenesi inserzionale “genomica” Quante linee bisogna produrre per saturare il genoma? Calcolo teorico: Il T-DNA si inserisce nel genoma seguendo una distribuzione di Poisson, quindi…… F (geni con almeno 1 inserzione= saturazione) =1 - e-m dovemrappresenta il numero medio di eventi per gene, i.e. m = numero di inserzioni indipendenti/numero di geni Se: 1.5 T-DNA locus per line 75/85% saturazione con 25.000 T-DNA lines Ma noi evidenziamo solo inserzioni in regioni codificanti, quindi ….CORREZIONE! 95% saturazione con circa 50.000 linee indipendenti

35. In Planta Vacuum Infiltration Raccolta semi T1 T0 Selezione in serra dei trasformanti T1 Basta resistenti Autoimpollinazione T2 Analisi in vitro delle plantule Kr Raccolta semi T2 Kr Ks • Analisi dei mutanti Kana resistenti • Propoagazione di piante omo ed eterozigoti Strategia di Isolamento Mutanti

36. Knockology

37. Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato??? • Analisi di segregazione • del marcatore e del fenotipo mutante • (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) • Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione • (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) • Analisi PCR su moooooolti mutanti • (es. mutante con fenotipo letale, • non è possibile ctrl la resistenza a Kana) • Clonaggio delle “Flanking Sequences”

38. autoimpollinazione Analisi di segregazione T2 Plantsaa(Kr/Kr) Aa(Kr/Ks)AA(Ks/Ks) Total 96 19394 383 1 2 1 T3 Plants xy1(Kr) WT(Kr/Ks) Ks Total a 24 4726 97 b 25 4624 95 c 27 5528 110 e 121 0 0 121

39. Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato??? • Analisi di segregazione • del marcatore e del fenotipo mutante • (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) • Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione • (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) • Analisi PCR su moooooolti mutanti • (es. mutante con fenotipo letale, • non è possibile ctrl la resistenza a Kana) • Clonaggio delle “Flanking Sequences”

40. 0,23 x 4,4 Digestione EcoRV: 0.23 Kb e 4,4 Kb interne al T-DNA x Kb fino al sito EcoRV sul DNA vegetale E.RV E.RV E.RV RB LB Erbic R GUS KanR Pnos 35S nos3’ ocs3’

41. NT Caratterizzazione Molecolare del sito di inserzione 1,8 Kb RB-LB IR 0,23 Kb 4,4 Kb 1,2 Kb RB-RB DR 0,23 Kb

42. Analisi di segregazione • del marcatore e del fenotipo mutante • (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) • Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione • (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) • Clonaggio delle “Flanking Sequences” Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato??? • Analisi PCR su moooooolti mutanti • (es. mutante con fenotipo letale, • non è possibile ctrl la resistenza a Kana)

43. Analisi per PCR • Estrazione DNA dai singoli mutanti (da seme/embrione se il fenotipo è letale) • PCR con oligo specifici per il T-DNA: Kana, RB, LB, Basta • Analisi dei prodotti di PCR su gel/Southern blotting

44. Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato??? • Analisi di segregazione • del marcatore e del fenotipo mutante • (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) • Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione • (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) • Analisi PCR su moooooolti mutanti • (es. mutante con fenotipo letale, • non è possibile ctrl la resistenza a Kana) • Clonaggio delle “Flanking Sequences”

45. Strategie di clonaggio delle “Flanking Sequences” - Plasmid Rescue - Inverse PCR (IPCR) - Libreria genomica da DNA mutante, con screening con sonda T-DNA

46. X X T-DNA Kana Amp GUS Ori Digestione X X T-DNA Ligazione intramolecolare T-DNA X X X Trasformazione E.coli Selezione colonie AmpR, su LB+Amp

47. Strategie di clonaggio delle “Flanking Sequences” - Plasmid Rescue - Inverse PCR (IPCR) - Libreria genomica da DNA mutante, con screening con sonda T-DNA

48. X X T-DNA Kana GUS Digestione X X T-DNA Ligazione intramolecolare PCR T-DNA X CC CC

49. - Plasmid Rescue - Inverse PCR (IPCR) Strategie di clonaggio delle “Flanking Sequences” - Libreria genomica da DNA mutante

50. Libreria genomica da DNA mutante • Digestione del DNA genomico mutante (omozigote) o di plantula KanaR (eterozigote) con enzimi adeguati x il clonaggio • Clonaggio del DNA genomico così digerito, in vettori x librerie genomiche (l, cosmidi) • Trasformazione (per elettroporazione) di cellule competenti di E.coli • Screening della libreria genomica con sonda T-DNA (Kana, RB, LB, Basta) • Isolamento dei cloni positivi, sequenza delle FS • Amplificazione delle FS x utilizzarle come sonda su una libreria genomica/cDNA WT • Isolamento della copia WT del gene/cDNA che, inattivato, è responsabile del fenotipo