KOLORIMETRIJA I SPEKTROFOTOMETRIJA

1. Instrumentalna analiza , Profesor Hemije KOLORIMETRIJA I SPEKTROFOTOMETRIJA Dr D. Manojlović, Hemijski fakultet Beograd

2. Kolorimetrijskim metodama se određuju koncentracije obojenih rastvora koji apsorbuju u vidljivom ili bliskom UV delu spektra Boja koju ima rastvor neke supstance komplementarna je boji koju ta supstanca apsorbuje Akva-bakar(II) jon je bledoplave boje, što znači da apsorbuje u žutom delu spektra

3. U kolorimetriji se uvek radi sa polihoromatskim zračenjem što isključuje mogućnostkvalitativne analize

4. Da bi se supstanca mogla odrediti kolorimetrijski mora ispunjavati sledeće uslove: - intenzitet boje mora biti stabilan u dužem vremenskom intervalu - boja mora biti intenzivna -apsorpcija zraćenja mora da se pokorava Lambert-Beerovom zakonu

5. -male promene temeprature, pH i drugih faktora nesmeju bitno da utiču na intenzitet boje Ukoliko je intenzitet neke boje nedovoljan onda se dodatkom pogodnog reagensa može prevesti u intenzivnije obojeno jedinjenje

6. Reagens u kolorimetriji mora da poseduje sledeće osobine : -reagens treba da reaguje stehiometrijski sa ispitivanom supstancom i uvek treba dodati dovoljnu i istu količinu reagensa u ispitivane rastvore i standarde -reagens ne sme da apsorbuje u vidljivom delu spektra -reagens mora biti selektivan u odnosu na ispitivanu supstancu

7. -boja nastalog proizvoda mora se brzo razvijati -reagens ili ispitivana supstanca ne smeju da stupaju u reakcije sa drugim sastojcima u rastvoru koji ih mogu prevesti u neaktivne oblike ili kompleksno jedinjenje zbog čega bi izostalo razvijanje boje U kolorimetriji se obično intenzitet boje nepoznatog rastvora upoređuje sa jednim ili više standardnih rastvora poznate koncentracije

8. Prema tehnici rada kolorimetrijske metode delimo na: metode standardne serije metode balansovanja metode kolorimetrijske titracije Aparati koji se koriste u kolorimetriji su jednostavne konstrukcije i kao izvor svetlosti koriste belu svetlost

9. Tipični kolorimetrijski aparati su Helligeovkomparator i Duboscquovkolorimetar.

10. Fotokolorimetrijske metode Optička shema fotoelektričnog kolorimetra

11. SPEKTROFOTOMETRIJA Spektrofotometrija je apsorpciona metoda koja se zasniva na praćenju zavisnosti apsorbance ili apsortiviteta od talasne dužine zračenja koje je prošlo kroz analiziranu supstancu Apsorpcija se može pratiti u UV, Vis, IC, mikrotalasnoj i radiofrekventnoj oblasti. U analitičkoj hemiji su od interesa oblasti od 200-1000 nm, a u organskoj analizi joši IC oblast, EPR i NMR spektroskopija

12. Spektrofotometrija je kvalitativna i kvantitativna analiza Kvalitativna analiza se zasniva na činjenici da apsorpcioni spektar supstance zavisi od njenog sastava i strukture Na osnovu zavisnosti apsortiviteta od talasne dužine i vrednosti apsortiviteta na određenoj talasnoj dužini moguće je identifikovati apsorbujuću supstancu

13. Kvantitativna analiza sa zasniva na Beerovom zakonu: Kod spektrofotometra bjejednako debljini kivete i konstantno je i onda apsorbanca zavisi samo od koncentracije i apsortiviteta Da bi se postigla moguća tačnost i osetljivost apsorbance bitan je izbor talasne dužine merenja

14. Ona mora da ispuni sledeće uslove: -da se merenjem postiže maksimalna osetljivost -da male promene talasne dužine ne utiču na reproduktivnost -da važi Beerov zakon

15. Na osnovu ovih zahteva merenje apsorbance se izvodi na: -na talasnoj dužini gde je apsorbanca maksimalna max -na taasnoj dužini optimalne apsorbance,opti -na talasnoj dužini izobestičke tačke,izob izob kada dva oblika imaju istu apsorbancu (kiseli i bazni indikator)

16. Shema spektrofotometra

17. DERIVATIVNA SPEKTROFOTOMETRIJA Derivativna spektrofotometrija je relativno nova metoda čija je primena u poslednje vreme jako porasla pre svega zahvaljujući razvoju računarske tehnike Primena derivativne spektrofotometrije: -Pogodna je pri analizi višekomponentnih sistema -Kvantitativno određivanje tragova u višekomponentnim sistemima

18. -Karakterizaciju čistih supstanci -Eliminiše ili smanjujeapsorbancu pozadinečime omogućava određivanja u suspenzijama, mutnim rastvorima -Derivatizacijom osnovnog spektra moguće je tačnije odrediti talasne dužine maksimumaširokih apsorpcionih traka

19. Dobijanje derivativnih spektara: -Optički -Elektronski -Matematički

20. Optički: Najmanje se smanjuje odnos signala i šuma Elektronski: Loš odnos signala i šuma, može se koristiti samo do četvrtog izvoda Matematički: Koristi se polinomska interpolacija, Furijeva transformacija

21. Optička metoda dobijanja derivativnih spektara se sastoji u modulaciji elektromagnetnog zračenja u nekoj oblasti talasnih dužina, koja se naziva interval modulacije Ispred monohromatora se postavi kvarcna pločica koja vibrira napred-nazad za nekoliko stepeni i samim tim izvodi modulaciju talasne dužine upadnog zračenjapo sinusoidalnom zakonu

22. Rezultujući signal se detektuje elektronski, detektorom koji je podešen na frekvenciju vibracije pločice . Amplituda rezultujućeg modulisanog snopa bićeproporcionalna nagibu apsorpcione trake unutar modulacionog intervla, a samim tim i prvom izvodu spektra, pod uslovom da je modulacioni interval dovoljno mali u odnosu na širinu trake

23. Elektronska metodaderivacije sastoji se od povezivanja električnog kola sa otpornikom i kondenzatorom (RC) na analogni izlaz detektorapomoću operacionog amplifikatora Ovde se dobija izvod u funkciji vremena, , ali se na osnovu poznate brzine skeniranja može izračunati izvod apsorbance po talasnoj dužini;

24. Kod ovakvog načina dobijanja derivativnih spektara veliki uticaj imaju instrumentalni parametri kao što su brzina skeniranja spektra, širina razreza, veličina pojačanja Pored toga svaki RC uređaj smanjuje odnos signala prema šumu za 2što ograničava metodu do četvrtog izvoda

25. Matematičke metode derivacije se danas najviše koriste Diferenciranje osnovnog spektra se izvodi bilo snimanjem spektra “tačku po tačku” (neregistrujućim uređajem ili uređajem sa jednim zrakom) i primenom formula za numeričko diferenciranje tako dobijenih vrednostiA=f() ili digitalizacijom spektra snimanjem registrujućim spektrofotometrima i primenom interpolacije i diferenciranja

26. Najčešće se koristi polinomska interpolacija, Furierova transformacija i interpolacija pomoću splajnova Nakontoga se, pomoću odgovarajućih numeričkih algoritama ovako dobijene interpolacione formulediferenciraju potreban broj puta.

27. Razlika absorbanci za dve bekonačno bliske talasne dužine1 i 2u osnovnom spektru,A= f(), podeljena veličinom spektralnog intervala =2-1, predstavlja prvi izvod tog spektra Daljim diferenciranjem dobijamo: Ako ovo primenimo na apsorpcionu trakugausovog oblika onda dobijam derivativnespektre

28. Derivativni spektri neparnog rada imaju malo sličnosti sa originalnim spektrom i složeniji su od njega Ono što je bitno za ove izvode je da prolaze kroz nulu (seku osu talasne dužine) apsorptivnog maksimuma što daje osnovu za kvalitativnu analizu. U praksi se od neparnih spektara koriste samo spektri prvog reda

29. Derivativni spektri parnog reda imaju centralnu traku (pik) promenjivog znaka (u drugom izvodu negativan, u četvrtom pozitivan), praćenu sa dve satelitske trake suprotnog znaka i znatno manjeg intanziteta od centralne trake

30. Maksimumi apsorpcije u osnovnom spektru odgovara maksimumu centralne trake parnog reda Poluširina te trake znatno je manja nego na osnovnom spektru i traka je uža ukoliko je red spektra veći pa parni izvodi imaju veću primenu od neparnih. Osnovna osobina izvoda je da su amplitude užih traka relativno veće od amplituda širokih traka

31. Za n-ti izvod bilo gausovske ili lorencovskeširine trake amplituda pika je povezana sa n-tim stepenom recipročne vrednosti širine trake, u osnovnom spektru, . Zbog toga za trake istih apsorbanci a različitih širina u osnovnom spektru, amplituda uže trake u derivativnom spektru je veća od amplitudešire trake za faktor koji raste sa porastom reda izvoda

33. Nedostatak derivativne tehnike da odnos signala prema šumu postaje lošijiprogresivno sa povećavanjem izvoda Zbog toga se javlja potreba da se izvede ravnanje spektra kako bi se ovaj odnos poboljšao i šum sveo na najmanju meru U tu svrhu se koriste različiti numerički algoritmi od kojih su najpoznatiji metodaA. Savitzkog i E. Golaya, metoda Furijerove transformacije i metoda splajn aproksimacije

34. Visok odnos signala prema šumu mora se postići pri nekom dozvoljenom nivou deformacije spektra s obzirom da se pri velikoj filtracijišuma povećavaju sistematske greške Drugi izvod spektra metil-digoksima snimljen na spektrofotometru Cary 3 Varian

35. Preciznost određivanja max Kada se apsorpcioni spektar sastoji od širokih traka tačan položaj maksimuma apsorpcije može se odrediti samo aproksimativno Na maxprvi izvod prolazi kroz nulu tako da se talasna dužina maksimuma apsorpcije može odrediti veoma precizno

36. Povećanje rezolutivnosti Primenom derivativnih spektara mogu se razdvojiti trake koje se preklapaju i ne mogu se razdvojiti niti razlikovati u osnovnom spektru Prvi i drugi izvod dve preklapajuće Gaussovske trake

37. Spektrofotometrija u suspenzijama i mutnim rastvorima Mutni rastvori i suspenzije ili emulzije jako otežavaju spektrofotometrijsku analizu Zbograsipanja zračenja koje raste sa smanjenjem talasne dužine na spektar uzorka se superponira manji ili veši intenzitet pozadine, a pored toga se gubi i intenzitet samog spektra

38. Zbog rasipanja zračenja na nehomogenostima sredine primena derivativnih spektara eliminiše uticaj fona na spektar analiziranog uzorka Apsorpciona trakau rasipajućojsredini i njen prvi izvod (a) Gaussovska traka (b) prvi izvod Spektar uzorka traka (A), Spektar pozadine traka(B), traka uzorka + pozadina (C) i odgovarajući prvi izvodi

39. Analiza tragova Određivanje tragova supstanci u različitim uzorcima izvodi se radi utvrđivanja njihove čistoće U osnovnom spektru prisustvo benzola se jedva uočava Tek u spektru 4-tog izvoda benzol se može kvantitativnoodrediti (AB je srazmerno koncentraciji benzola). Određivanje benzola u etanolu.I – etanol, II-etanol +1 ppmbenzola, III-etanol + 10 ppm benzola, IV-4-ti-izvod od II, V-4-ti izvod od III

40. Kvantitativna nalaiza Kod kvantitativne derivativne spektrofotometrije meri se samo amplituda trake u derivativnom spektru u zavisnosti od koncentracijie jer je koncentracija linearno povezana sa amplitudom n-tog izvoda Merenja amplitude mogu biti rezultat računarskog izračunavanja, ali može da se izvede i gafički, a važenje Lamber-Beerovog zakona kao i aditivnost apsorbance se podrazumeva

41. Za određivanje amplitude koriste se sledeće metode: -piki-pik maetoda, kod koje se meri rastojanje između maksimuma i njemu odgovarajućeg minimuma -metoda tangente kada se povlači tangenta između dva susedna maksimuma (ili minimuma) i meri rastojanje između tangente do maksimuma (ili minimuma) između tih maksimumaparalelno sa ordinatom -pik-nula metoda gde se meri rastojanje od maksimuma ili minimuma do apscise paralelno sa ordinatom.

42. Ova metoda se koristi kod spektara višeg rada koji imaju simetrične pikove u odnosu na apscisu (spektri prvog reda) Obrada derivativnog spektra. Metoda tangente (t), pik-pik metoda (p) i pik-nula metoda (z).

43. Arsenazo III gradi obojene komplekse sa Th(IV) i U(IV) jonima sa maksimumima apsorpcije na oko 665 nm. Drugi izvod kompleksa U pokazuje dve nule na 650 i 684 nm, a Th na 648 i 680 nm. Nulte tačke na 680 i 684 nm mogu se koristiti za simultano određivanje metala u smesi. Na nultoj tački Th (680 nm) meri se amplituda apsorpcije U, a na nultoj tački apsorpcije U (684nm) meri se amplituda kompleksa Th.