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分子生物学实验. 生物与食品工程学院 基础实验教育中心. 实验一、动物基因组的提取 实验二、基因组 DNA 的电泳分析 实验三、质粒的转化 实验四、质粒的提取 实验五、 PCR 扩增和产物检测. 目 录. 实验一、动物基因组的提取. 一、实验目的. 对遗传物质 DNA 有个基本的感性认识； 掌握动物基因组 DNA 提取和检测的基本方法。. 二、实验原理. 1 、材料 ------ 鸡红细胞. 二、实验原理. 2 、裂解细胞及纯化 DNA ： 低渗破细胞； SDS （十二烷基磺酸钠）使蛋白质变性并与 DNA 分离； 蛋白酶 K 溶解蛋白质；
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分子生物学实验 生物与食品工程学院 基础实验教育中心
实验一、动物基因组的提取 实验二、基因组DNA的电泳分析 实验三、质粒的转化 实验四、质粒的提取 实验五、PCR扩增和产物检测 目 录
一、实验目的 • 对遗传物质DNA有个基本的感性认识； • 掌握动物基因组DNA提取和检测的基本方法。
二、实验原理 1、材料------鸡红细胞
二、实验原理 2、裂解细胞及纯化DNA： • 低渗破细胞； • SDS（十二烷基磺酸钠）使蛋白质变性并与DNA分离； • 蛋白酶K溶解蛋白质； • 有机相纯化DNA： • 乙醇降低DNA在 水溶液中的 溶解度而使DNA析出。 酚：变性和溶解蛋白质 氯仿：沉淀蛋白
二、实验原理 3、基因组DNA鉴定： • 根据核酸与蛋白质分别在OD260和OD280有吸收峰分别测定之，比较OD260/OD280比值在1.8附近程度估计纯度，依据经验公式计算DNA含量。 [DNA](g/ l)=260nm吸光值×稀释倍数×50 • 琼脂糖电泳测定（见实验二）
三、实验所需试剂和仪器 1、仪器和器材： 水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计、冰箱、移液器和离心管。 2、试剂： • 细胞裂解液 • Tris平衡酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、TE缓冲液和双蒸水。
四、实验步骤 ① 生理盐水 ② 采集鸡血（抗凝） 稀释至 细胞浓度 约为5×105个/ml 收集血细胞 4000rpm 按照一定 比例配 置细胞裂 解混合液 ③ ④ +等体积 ⑤ 55℃裂解作用 4h以上 震荡混匀 作用10′ 吸取上层水相 Tris平衡酚 10000rpm +等体积 的酚氯仿 异戊醇 混合液 ⑥ ⑦ +2倍等体积 震荡混匀 作用10′ 震荡混匀 作用3′ 吸取上层水相 （重复⑥） 10000rpm 无水乙醇
四、实验步骤 10000rpm 取沉淀 +1ml 70%的乙醇 洗涤 8000rpm 留取沉淀 +50 l TE或灭菌双蒸水 -20 ℃贮存 检测 55℃水浴至DNA溶解
五、注意事项 • Tris平衡酚有强氧化性，操作时需带好手套； • 抽提过程中避免吸取蛋白质层； • 使用离心机必须平衡； • 操作过程中所用的离心管 、移液尖和试剂需灭菌处理。
六、实验结果 1、记录实验过程中所观查到的实验现象； 2、比色法测定DNA的浓度。
七、思考题 • 为什么在DNA抽提过程中不能激烈得振荡？推断一下否则会出现什么样的结果？
普通冰箱 超低温冰箱
移液器 移液器枪头
一、实验目的 • 学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理； • 掌握基因组DNA的电泳分析。
二、实验原理 • DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 • 核酸为两性分子，在PH3.5时，整个分子带正电； pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。
二、实验原理 • 在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度 不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。 • 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。
二、实验原理 • 共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。
三、实验所需试剂和仪器 1、仪器和器材： 稳压电泳仪和电泳槽、冰箱、电子天平、紫外线透射仪、凝胶成像系统、移液器和离心管。 2、试剂： • 50× TAE储液(pH8.0) 使用时稀释 50倍成1×TAE 。 • 6 ×凝胶加样缓冲液 0.2%溴酚蓝，30%甘油 • 琼脂糖 • 10mg/ml溴化乙锭溶液（EB），4℃保存。 用时稀释成5 g/ml的EB。
四、实验操作流程 ⑴ 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。 ⑵ 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。 ⑶ 充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。
四、实验操作流程 ⑷ 用移液器吸取1μl的6X载样缓冲液于封口膜上, 加入总DNA或质粒样品2μl，加灭菌蒸馏水补足6μl， 混匀后，小心加入点样孔。 ⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-40min。 ⑹ 将凝胶放入EB染液中染色5-10min，用清水稍微漂洗。 ⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。
五、注意事项 • 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上，调整好梳子的高度；称取0.3g琼脂糖于30 ml 1×TAE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50ºC时倒入制胶板中； • 凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带； • 将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中； • 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动； • 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 µg/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色10－15 min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。
六、实验结果 1、记录实验过程中所观查到的实验现象； 2、照片记录琼脂糖电泳结果，并分析自己所提取的基因组DNA质和量。
七、思考题 • 配置琼脂糖凝胶时确定琼脂糖浓度的依据 是什么？
范例 • 基因组DNA样品应呈现一条迁移率 很小的整齐条带。 • 质粒DNA应呈现二或三条不同构型的条带，这时表明所提样品较纯。溴酚蓝前的荧光区是样品中存有的RNA杂质。若质粒DNA样品在迁移率小的地方还有荧光条带，表明质粒DNA样品中有细菌的染色体DNA污染。
紫外线透射仪 凝胶成像系统（UVP）
