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台湾地区芽胞杆菌种类多样性研究

台湾地区芽胞杆菌种类多样性研究. 姓 名：田潇娜 专 业：生物化学与分子生物学 导 师：刘 波 博士、研究员 副导师：葛慈斌 副研究员. 福建农林大学、福建省农业科学院 2013 年 5 月 30 日. 主要内容. 一 、研究背景与意义 二 、技术路线 三 、研究内容 四 、讨论与小结. 一、研究背景与意义. 1. 芽胞杆菌研究概述. 棒状杆菌，多数以侧生鞭毛或周生鞭毛运动 ； 为革兰氏阳性菌 ，需氧或兼性厌氧。 能够在各种极端环境下生存 。

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台湾地区芽胞杆菌种类多样性研究

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Presentation Transcript

  1. 台湾地区芽胞杆菌种类多样性研究 姓 名：田潇娜 专 业：生物化学与分子生物学 导 师：刘 波 博士、研究员 副导师：葛慈斌 副研究员 福建农林大学、福建省农业科学院 2013年5月30日

  2. 主要内容 一 、研究背景与意义 二 、技术路线 三 、研究内容 四 、讨论与小结

  3. 一、研究背景与意义 1. 芽胞杆菌研究概述 • 棒状杆菌，多数以侧生鞭毛或周生鞭毛运动； • 为革兰氏阳性菌，需氧或兼性厌氧。 • 能够在各种极端环境下生存。 • 在工、农、医、军事和科学研究中均有广泛的应用价值。

  4. 一、研究背景与意义 2. 芽胞杆菌的系统分类 芽胞杆菌的经典分类学特性 芽胞杆菌的分子分类学特性 芽胞杆菌的脂肪酸分类学特性 gyrB基因在芽胞杆菌分类中的应用

  5. 一、研究背景与意义 3. 微生物多样性 4. 芽胞杆菌多样性 • 芽胞杆菌是土壤微生物的重要组成部分，在土壤生态系统中占有重要地位； • 王子璇等（2012）对新疆不同地区的芽胞杆菌种类及其多样性进行了调查；张华勇等（2003）对红壤地区芽胞杆菌的采集种类多样性进行了分析。 • 土壤环境中微生物群落的多样性在某种程度上反应了生态系统的多态性； • 微生物研究较多的为不同植被、不同贫瘠程度和不同理化性质土壤微生物多样性。

  6. 一、研究背景与意义 5. 研究意义 • 台湾位于中国大陆东南沿海的大陆架上； • 跨温带与热带之间，属于热带和亚热带气候； • 四面环海，受海洋性季风调节，台湾岛地形中间高、两侧低； • 台湾省台东山地、台中丘陵、西部为盆地，台西平原； • 水产资源颇为丰富。

  7. 一、研究背景与意义 5. 研究意义 • 台湾地区特殊的环境气候类型、地形特征和名贵资源的存在决定了台湾地区生态丰富而多样，因此可能存在丰富的芽胞杆菌资源； • 目前对台湾地区芽胞杆菌多样性的研究仅局限于苏云金芽胞杆菌（Chen et al.，2004；Cnak et al.，1994，1990）； • 各地区芽胞杆菌种类系统的分布尚未见报道。

  8. 二、技术路线 土壤中芽胞杆菌的分离 提取DNA 数量多样性分析 提取脂肪酸 形态特征鉴定及生化实验 gyrB基因序列扩增 MIDI检测 16S rDNA序列扩增 Clustal X多重序列比对 FA多样性分析 多样性分析 地理分化分析 Mega 4 构建系统进化树

  9. 三、研究内容 • 台湾芽胞杆菌的分离与保存 • 芽胞杆菌的鉴定 • 芽胞杆菌的多样性分析 • 芽胞杆菌的地理分化分析 • 芽胞杆菌的gyrB基因序列扩增

  10. 三、研究内容 1. 台湾土壤中芽胞杆菌的分离与保存 土壤样本的采集 • 芽胞杆菌的FA鉴定分析 • 芽胞杆菌的地理分化分析 • 芽胞杆菌形态染色及生化实验 • 芽胞杆菌的数量多样性分析 土样采集于台湾9个市（县），采用五点采样法分别取5-20 cm深度的土壤，供采集23个土壤样本。

  11. 三、研究内容 1. 台湾土壤中芽胞杆菌的分离与保存 采样 土壤悬浮液 稀释 80 ℃水浴 • 芽胞杆菌的FA鉴定分析 • 芽胞杆菌的数量多样性分析 涂布 保存 挑取菌苔 培养 采用平板稀释涂布法分离、-80℃甘油保存

  12. 三、研究内容 2. 芽胞杆菌的鉴定 • 芽胞杆菌的FA鉴定分析 • 芽胞杆菌的多样性分析 • 芽胞杆菌的地理分化分析 • 芽胞杆菌形态染色及生化实验 • 芽胞杆菌的数量多样性分析 序列比对的结果表明，这154个菌株归属于25个种

  13. FJAT-14603KC0 13928 35 三、研究内容 FJAT-14569KC 479329 19 B. firmus NCIMB 9366(T) 67 24 FJAT-14602KC0 13927 B. oceanisediminis H2(T) FJAT-14559KC0 13923 27 B. infantis SMC 4352-1(T) 2. 芽胞杆菌的鉴定 8 68 FJAT-14429KC0 13913 B. asahii MA001(T) 91 B. megaterium IAM 13418(T) 27 FJAT-14537KC 479328 FJAT-14439KC0 13916 96 所有芽胞杆菌分为7大类，其中鉴定为B. cereus、B. anthracis和B. pseudomycoi-des的菌株聚在一起，均为蜡状芽胞杆菌组菌株； B. infantis和B. oceanisedimi-nis构成一个分支，B. firmus与其亲缘关系比较近，聚在一起；B. aryabhattai和B. megaterium进化距离非常接近可以分为一个组，B. asahii与其聚在一起成一支； L. xylanilyticus、L. macroides、L. fusiformis和L. sphaericus均为Lysinibacillus属菌株，聚在一起。 10 FJAT-14432KC 479326 69 B. aryabhattai B8W22(T) FJAT-14428KC0 13912 85 B. marisflavi TF-11(T) FJAT-14454KC0 13931 74 B. mojavensis RO-H-1(T) B. subtilis subsp. inaquosorum BGSC 3A28(T) 31 99 FJAT-14523KC 479327 FJAT-14481KC0 13917 30 B. anthracis Ames(T) FJAT-14563 KC0 13924 83 B. cereus ATCC 14579(T) 93 FJAT-14613KC0 13930 B. anthracis ATCC 14578(T) 2 FJAT-14586KC0 13926 4 FJAT-14427KC0 13911 9 B. pseudomycoides DSM 12442(T) 65 FJAT-14535KC0 13922 B. drentensis LMG 21831(T) 88 FJAT-14491KC0 13919 91 B. aerophilus 28K(T) B. simplex NBRC 15720(T) B. muralis LMG 20238(T) 98 FJAT-14498KC0 13920 54 16 FJAT-14435KC0 13914 • 芽胞杆菌形态染色及生化实验 FJAT-14607KC0 13929 95 B. idriensis SMC 4352-2(T) FJAT-14438KC0 13915 38 67 L. xylanilyticus XDB9(T) FJAT-14485KC0 13918 • 芽胞杆菌的数量多样性分析 92 L. macroides LMG 18474(T) 51 FJAT-14564KC0 13925 53 L. sphaericus C3-41(T) 13 FJAT-14510KC0 13921 16 L.fusiformis NBRC 15717(T) 67 0.005

  14. 三、研究内容 3. 芽胞杆菌的多样性分析 3.1 芽胞杆菌的形态多态性 FJAT-14429 FJAT-14498 FJAT-14559 FJAT-14602 • 台湾地区9个市（县）23份土壤中分离到154株芽胞杆菌； • 菌株的菌落大小、形态各异，从总体来看，大致分为25类； • 芽胞杆菌在菌落形态上呈现多态性； • 部分菌株进化距离较近，菌落大小、颜色和光滑度等均有较大差异； • 某些菌落形态几乎完全不同，但鉴定结果显示进化距离较近。

  15. 三、研究内容 3. 芽胞杆菌的多样性分析 3.2 芽胞杆菌种类样本分布的多样性 • 芽胞杆菌的FA鉴定分析 • 芽胞杆菌形态染色及生化实验 • 芽胞杆菌的数量多样性分析 芽胞杆菌种类数量在总分离种类数量中所占的比例差别较大，台北市各土壤样本的芽胞杆菌种类数占总分离种类数的比例从8%到28%不等，南投县各样本所占比例为8%至16%。

  16. 三、研究内容 3. 芽胞杆菌的多样性分析 3.3 芽胞杆菌种类县域分布的多样性 • 芽胞杆菌的FA鉴定分析 • 芽胞杆菌形态染色及生化实验 • 芽胞杆菌的数量多样性分析 土壤样本中分离出芽胞杆菌种类数最多的是台北市和桃园县，分别占总采集种类数的48%和40%；基隆市和南投县次之，均为8种，占总采集种类数的32%；台湾中部的新竹县、苗栗县和台中市分离出的芽胞杆菌种类数量相同。

  17. 三、研究内容 3. 芽胞杆菌的多样性分析 3.4 芽胞杆菌种类分布的多样性 各市（县）芽胞杆菌平均种类统计结果显示新竹县、苗栗县和台中市芽胞杆菌平均种类相对较高，除桃园县和嘉义市外，其变化呈现向南北两侧依次递减的趋势。 • 芽胞杆菌的FA鉴定分析 • 芽胞杆菌形态染色及生化实验 • 芽胞杆菌的数量多样性分析

  18. 三、研究内容 3. 芽胞杆菌的多样性分析 3.4 芽胞杆菌种类分布的多样性 • 芽胞杆菌形态染色及生化实验 • 芽胞杆菌的数量多样性分析 多样性指数平均值最低的为南投县和高雄市，为1.64624和1.29248，其次为基隆市和桃园县，多样性指数分别为1.83062和1.84576，新竹县、苗栗县和台中市的芽胞杆菌采集种类多样性指数相同为2.32193。

  19. 三、研究内容 3. 芽胞杆菌的多样性分析 3.4 芽胞杆菌种类分布的多样性 • 芽胞杆菌形态染色及生化实验 • 芽胞杆菌的数量多样性分析 芽胞杆菌多样性指数平均值变化趋势，除桃园县和嘉义市，变化呈现向南北两侧依次递减的趋势。变化趋势和台湾各市县芽胞杆菌平均种类统计结果变化趋势一致。

  20. 三、研究内容 3. 芽胞杆菌的多样性分析 3.4 芽胞杆菌种类分布的多样性 • 芽胞杆菌形态染色及生化实验 • 芽胞杆菌的数量多样性分析 芽胞杆菌可聚为3类，B. aryabhattai和B. cereus为一类，B. thuringiensis为一类，其余的种类为一类。 台湾的各市（县）聚为3类：新竹县自成一类，苗栗县和嘉义县成一类，其余县市为一类。

  21. 三、研究内容 3. 芽胞杆菌的多样性分析 3.5 芽胞杆菌样本PLFA多样性分析 • 芽胞杆菌的多样性分析 • 芽胞杆菌的地理分化分析 • 芽胞杆菌形态染色及生化实验 • 芽胞杆菌的数量多样性分析 各市（县）样本的脂肪酸多样性和均匀度指数有较大差异，特别是样本数较多的市（县），其多样性和均匀度指数差异更大；同一市（县）不同生境对芽胞杆菌脂肪酸多样性影响是巨大的。

  22. 三、研究内容 3. 芽胞杆菌的多样性分析 3.6 芽胞杆菌PLFA主成分分析 • 芽胞杆菌的多样性分析 • 芽胞杆菌的地理分化分析 • 芽胞杆菌形态染色及生化实验 • 芽胞杆菌的数量多样性分析 所有芽胞杆菌脂肪酸中，含量最多的为15:0 ISO和15:0 ANTEISO，其中15:0 ISO达到所有脂肪酸的将近50%。而15:0 ANTEISO和17:0 ISO累计百分率分别达到了55.92和67.55。其含量最多的脂肪酸均为蜡状芽胞胞杆菌组和巨大芽胞杆菌菌株。

  23. 三、研究内容 3. 芽胞杆菌的多样性分析 3.7 芽胞杆菌样本数量统计分析 台湾地区各土壤中芽胞杆菌的数量差距很大，芽胞杆菌数量最多的是采自台北阳明山花钟的样本，达到2.2×106 cfu·g-1，数量最少的仅有1.5×104 cfu·g-1。采集自同一市（县）的土壤样本，每个样本的芽胞杆菌数量差距也比较大； B. aryabhattai为主要的芽胞杆菌菌群，其次为B. thuringiensis和B. anthracis。

  24. 三、研究内容 3. 芽胞杆菌的多样性分析 3.8 芽胞杆菌县域数量统计分析 除新竹县和高雄外，其他市（县）含量最多的芽胞杆菌均为B. aryabhattai，其中最多的是台北市，最少的为嘉义市。 台湾中部市（县）芽胞杆菌数量最多，整体上向北或向南依次递减，只在桃园县和新竹县有所变化。

  25. 三、研究内容 B. aryabhattai+南投+台一农场+FJAT-14524 59 B. aryabhattai+苗栗+西湖高速休息区+FJAT-14555 B. aryabhattai+台北+阳明山花钟+FJAT-14426 47 B. aryabhattai+桃园+桃园大溪九里香+FJAT-14489 50 B. aryabhattai+南投+台一农场+FJAT-14527 4. 芽胞杆菌的地理分化分析 59 B. aryabhattai+桃园+高速中坜休息区+FJAT-14440 B. aryabhattai+台北+士林官邸草坪+FJAT-14592 9 B. aryabhattai+台北+士林官邸芭乐树下+FJAT-14446 51 B. aryabhattai+台北+士林官邸白千层树下+FJAT-14452 5 B. aryabhattai+苗栗+西湖高速休息区+FJAT-14556 6 B. aryabhattai+桃园+慈湖蒋寝+FJAT-14514 5 B. aryabhattai+台北+士林官邸白千层树下+FJAT-14451 2 B. aryabhattai+台中+台大农学院+FJAT-14534 B. aryabhattai+南投+台一农场+FJAT-14525 23 B. aryabhattai+桃园+高速中坜休息区+FJAT-14439 B. aryabhattai+台北+阳明山蒋介石雕像+FJAT-14434 31 24 B. aryabhattai+台北+阳明山花钟+FJAT-14424 B. aryabhattai+南投+中台寺+FJAT-14505 • 芽胞杆菌的数量多样性分析 B. aryabhattai B8W22 T B. aryabhattai+桃园+慈湖石像群+FJAT-14539 B. aryabhattai+桃园+桃园大溪九里香+FJAT-14490 61 在B. aryabhattai进化树中，分离自台北市和桃园县的B. aryabhattai聚在一起，台北市或桃园县的各自聚在一起。分离自南投县和苗栗县的B. aryabhattai是分开的。 B. aryabhattai+台中+台大农学院+FJAT-14533 61 B. aryabhattai+台中+台大农学院+FJAT-14530 61 B. aryabhattai+桃园+慈湖黄花槐+FJAT-14513 76 95 B. aryabhattai+苗栗+西湖高速休息区+FJAT-14557 0.0001

  26. B. anthracis+南投+日月潭宏观寺+FJAT-14563 B. thuringiensis+桃园+桃园大溪九里香+FJAT-14483 41 68 三、研究内容 B. anthracis+桃园大溪九里香+FJAT-14488 B. thuringiensis+台北+阳明山花钟+FJAT-14425 40 67 38 B. anthracis+台北+士林官邸草坪+FJAT-14591 62 B. thuringiensis+高雄+高雄农友种业+FJAT-14597 38 66 B. anthracis+南投+台一农场+FJAT-14522 4. 芽胞杆菌的地理分化分析 B. thuringiensis+南投+中台寺+FJAT-14502 30 65 B. anthracis+南投+日月潭日潭+FJAT-14479 B. thuringiensis+台中+台大农学院+FJAT-14531 66 B. anthracis+南投+日月潭宏观寺+FJAT-14560 66 B. thuringiensis+南投+日月潭日潭+FJAT-14478 B. anthracis+台北+阳明山蒋介石雕像+FJAT-14436 B. thuringiensis ATCC 10792T B. anthracis+桃园+桃园大溪九里香+FJAT-14486 B. thuringiensis+桃园+高速中坜休息区+FJAT-14442 B. anthracis B. thuringiensis+新竹+食品研究所+FJAT-14497 66 B. thuringiensis+台北+士林官邸芭乐树下+FJAT-14448 0.00005 0.0002 B. anthracis聚类中，台北市和桃园县的基本聚在一起，而南投县的也大多聚在一起。在B. thuringiensis的系统分类中，可能是由于其在蜡状芽胞杆菌组的进化地位相对靠后，地理分布不明显。很大程度上还是倾向于南北方各自距离比较接近。

  27. 三、研究内容 4. 芽胞杆菌的地理分化分析 基于地理分化的芽胞杆菌PLFA分析 • 芽胞杆菌的FA鉴定分析 • 芽胞杆菌的多样性分析 • 芽胞杆菌形态染色及生化实验 • 芽胞杆菌的数量多样性分析 B. megaterium含量最多的脂肪酸为15:0 ISO、15:0 ANTEISO和16:0 B. cereus含量最多的脂肪酸为15:0 ISO、17:0 ISO和13:0 ISO

  28. 三、研究内容 4. 芽胞杆菌的地理分化分析 基于地理分化的芽胞杆菌PLFA分析 • 芽胞杆菌的FA鉴定分析 • 芽胞杆菌形态染色及生化实验 • 芽胞杆菌的数量多样性分析 • 台北市、南投县、高雄市和桃园县均聚在一起； • B. cereus聚类中苗栗县、新竹县和台中市聚在一起。

  29. 三、研究内容 5. 芽胞杆菌的gyrB基因序列扩增 gyrB基因鉴定结果及与16S rDNA鉴定结果的比较

  30. 98 FJAT-14560 三、研究内容 97 FJAT-14502 81 FJAT-14478 FJAT-14563 18 49 Bacillus cereus E33L chromosome 5. 芽胞杆菌的gyrB基因序列扩增 FJAT-14585 7 FJAT-14594 FJAT-14577 100 FJAT-14586 68 FJAT-14529 台湾地区分离的蜡状芽胞杆菌主要为B. cereus E33L chromosome和 B. cereus NC7401，它们各自聚为一束； 巨大芽胞杆菌主要有B. megaterium DSM 319，B. megaterium WSH-002和B. megaterium QM B1551三株； 运用gyrB基因序列可以有效地进行芽胞杆菌的种下分类鉴定。 53 FJAT-14604 66 Bacillus thuringiensis BMB171 100 FJAT-14521 55 FJAT-14606 67 FJAT-14445 68 Bacillus cereus NC7401 100 FJAT-14541 100 FJAT-14554 FJAT-14570 97 FJAT-14572 37 FJAT-14537 93 38 Bacillus megaterium DSM 319 FJAT-14451 43 Bacillus megaterium WSH-002 FJAT-14484 97 Bacillus megaterium QM B1551 99 FJAT-14539 74 FJAT-14490 FJAT-14424 94 FJAT-14446 FJAT-14533 55 FJAT-14584 FJAT-14426 FJAT-14430 FJAT-14452 FJAT-14486 FJAT-14479 Bacillus cereus B4264 Bacillus weihenstephanensis KBAB4 100 54 Bacillus thuringiensis serovar chinen... 97 Bacillus cereus G9842 0.1

  31. 四、讨论与小结 1. 讨论 台湾地区芽胞杆菌分离种类特殊性 台湾地区芽胞杆菌区系调查 台湾地区芽胞杆菌种类多态性 台湾地区芽胞杆菌数量和脂肪酸分布特点

  32. 1 首次对台湾地区芽胞杆菌多样性进行系统调查，通过经典16S rDNA序列鉴定方法对台湾地区各采集样本及各县市芽胞杆菌种类进行统计分析，并利用系统发育关系进行地理分化分析 3 2 分离鉴定了一些此前尚未在台湾或大陆分离到的芽胞杆菌种类，它们在台湾特定的生态环境中生长，具有一定的研究意义； 用多种方法从多个角度对台湾芽胞杆菌进行讨论 从台湾芽胞杆菌的数量分布特征和脂肪酸分布等多个角度对其多样性进行分析； 台湾芽胞杆菌种类和数量都呈现一定的规律性变化 四、讨论与小结 2. 小结

  33. 发表文章及试验报告整理 田潇娜，刘国红，刘波，林营志. 系统发育标记基因在芽胞杆菌分类鉴定中的应用[J]. 武夷科学，2011，27（1）：43-49. 田潇娜，刘波，刘国红，唐建阳，林营志. 台湾地区芽胞杆菌种类多样性及地理分化[J]. 生态学报.（待发表） 整理试验报告81篇。

  34. 致 谢 • 感谢导师刘波研究员、副导师葛慈斌副研究员的悉心指导。刘波导师活跃的学术思想，严谨求实的学术态度，忘我的工作精神和宽容豁达的人生态度深深的影响了我，给予的关怀和教诲使我受益匪浅。在论文完成之际，特向恩师表示崇高的敬意和感谢。感谢刘国红师姐在试验期间的认真指导和帮助。 • 感谢课题组工作人员在试验过程中的帮助和指导。 • 特别感谢我的父母和家人在我多年的求学路上给予的物质和精神上的莫大支持和关爱。 • 最后，向所有帮助过我的老师和同学致以诚挚的谢意！

  35. Thank you !

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