1 2 3 4 5 6 7

1. 5. SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ II5.1. SDS-PAGE Anna Kotrbová-KozakJana Vobořilová,Vlasta Fürstová,Tereza Kopská

2. SDS-PAGE(= sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)-metoda pro separaci proteinů dle jejich velikosti

3. Jednotlivé kroky experimentu*Příprava polyakrylamidových gelů*Příprava vzorků pro SDS-PAGE*Povaření vzorků při 95C po dobu4min.*Aplikace vzorků na gel*Vlastní elektroforesa probíhá při konstantním napětí 200 V po 30-40 min*Barvení gelu pomocí Coomassie Blue *Odbarvení gelu MetOH/HOAc *Identifikace myosinu a aktinu ve vzorcích tkaně pomocí proteinového markeru

4. 1 2 3 4 5 6 7 Separace proteinů v akrylamidovém gelu Myosin (těžký řetězec) Aktin Tropomyosin Myosin (lehký řetězec) Myosin (lehký řetězec) Myosin (lehký řetězec) 1. Marker 5. Aktin 2. Játra 6. Myosin 3. Srdce 7. Marker 4. Sval

5. -proteiny jsou tepelně denaturovány ve vzorkovém pufru obsahujícím dodecyl sulfát sodný (SDS)- zachována je tak pouze jejich primární struktura -denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj daný vazbou SDS – migrace tedy závisípouze na jejich molekulové hmotnosti

6. Pohyb takto upravených proteinů v elektrickém poli:-proteiny mající negativní náboj se pohybují směrem ke kladně nabité elektrodě

7. s-s SDS, zahřátí - + Proteiny s SDS Jak funguje SDS-PAGE? • Negativněnabité proteiny se pohybujíke kladné elektrodě • Menší proteiny se pohybují rychleji • Proteiny serozdělují • podle velikosti • (molekulové • hmotnosti)

8. Co obsahuje vzorkový pufr pro SDS-PAGE?*Trispufr utváří vhodné pH*SDS (dodecyl sulfát sodný)detergent poskytující proteinům negativní náboj*Glycerolvzhledem ke své vyšší specifické hmotnosti zajišťuje klesnutí vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení *“Bromophenol Blue“barvivo umižňující sledovat průběh elektroforézy (pohyb čela v gelu)

9. CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 O O O S - O SDS-PolyacrylamideGel Electrophoresis (SDS-PAGE) • SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) aniontový detergent • solubilizuje a denaturuje proteiny • dodává proteinům negativnínáboj • Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru, asi 1,4 g SDS/g proteinu • Zvýšená teplota denaturuje proteiny SDS

10. Proč používatakrylamidovýgel kseparaciproteinů? • Akrylamidový gel:pevnáa inertní matrix • Ideálnípro separaci proteinů • Menší velikost pórů než u agarosy • Proteinyjsoumenší než intaktní chromoz. DNA Gel je vytvořen polymerací aktylamidu a N´,N´-methylenbisakrylamidu zahájenou volnýmí radikály vzniklými při rozkladu persíranu amonného.

11. Molekulová hmotnost proteinů • velikostměřenavdaltonech (Da) či kilodaltonech (kDa) • Dalton = jednotka atomové hmotnosti = přibližně se rovná hmotnosti atomu vodíku (1,66 x 10 -24 g) = definován také jako 1/16 hmotnosti atomu kyslíku • Průměrná aminokyselina = 110 Da • Průměrný nukleotidový pár = 649 Da

12. Hlavní proteinové složení svalů ProteinkDaFunction titin 3000 center myosin in sarcomere dystrophin 400 anchoring to plasma membrane filamin 270 cross-link filaments into gel myosin heavy chain 210slide filaments spectrin 265 attach filaments to plasma membrane nebulin 107 regulate actin assembly a-actinin 100 bundle filaments gelosin 90 fragment filaments fimbrin 68 bundle filaments actin42form filaments tropomyosin 35 strengthen filaments myosin light chain 27slide filaments troponin (T, I, C) 30, 19, 17 mediate regulation of contraction thymosin 5 sequester actin monomers

14. Imunochemická detekce proteinů = WESTERN Blot Analýza *transfer proteinů separovaných pomocí SDS-PAGE z gelu na membránu *identifikace proteinu pomocí imunodetekce, tj. komplexu primární a případně sekundární protilátky *vizualizace pomocí barevné reakce nebo chemiluminiscence

15. WESTERN blot(metoda detekce proteinu):-název vznikl jako slovní hříčka dle metody Southern blot (technika detekce DNA) zavedené Edwardem Southernem -analogicky byl vytvořen také název pro metodu NORTHERN blot (technika detekce RNApřez nesporné kvality Lysenkovy a Mičurinovy vědecké školy se sovětským vědcům nepodařilo vyvinou vlastní metodu Eastern blotu