André P. Gerber, Daniel Herschlag, Patrick O. Brown. PLos Biology Março 2004 vol2 (3) 342-354

1. Extensive Association of Functionallyand Cytotopically Related mRNAswith Puf Family RNA-Binding Proteins in Yeast André P. Gerber, Daniel Herschlag, Patrick O. Brown. PLos Biology Março 2004 vol2 (3) 342-354

2. Dinâmica celular: • síntese e localização das macromoléculas Fatores de transcrição: • regulam o início da transcrição ao se ligar a seqüências de DNA próximas aos genes que serão regulados E a regulação Pós-transcricional?

3. Quem são as proteinas Puf? • Estrutura do mRNA os mRNA são controlados por elementos regulatórios associados às suas regiões 5’ UTR e 3’ UTR. Proteínas ligadoras de RNA (RBP) podem identificar sequencias específicas no mRNA. As proteínas Puf pertecem ao grupo de proteínas ligadoras de mRNA.

4. Proteínas Puf • Histórico: PumilioDrosophila melanogaster FBF Caernorhabiditis elegans • Ligação ao mRNA: As pPuf ou Pum- HD se ligam ao mRNA através de um domínio clássico de ligação ao RNA (RBP) e por repetições do domínio Puf (Pumilio- fem3- binding- Factor).

5. Estrutura da molécula pPuf: domínio RBP (RNA binding protein). domínio Puf ou Pum-HD: 8 repetições Puf (3 α-hélices) molécula curvada toda molécula interage com mRNa mólecula bastante conservada em eucariotos múltiplas famílias em uma mesma espécie

6. Estrutura de um domínio Puf ou Pum-HD

7. pPuf em leveduras Saccharomyces cerevisae: • muitas proteínas Puf citoplasmáticas. • 5 famílias pPUF: pPuf1 a pPuf5. • implicação nos processos de regulação pós-transcricional de expressão de diversos genes. • a pPuf atua nas regiões não traduzidas (UTR) do mRNA 5’ e 3’.

8. Domínios estruturais das pPuf de levedura

9. Objetivo: • Identificar os específicos mRNA que interagem com as pPuf do S. cerevisae e as características destas interações. Experimentos: • Isolar os mRNA ligados às pPUf específicas, pelo método TAP-Tag. • DNA microarrays das sequencias purificadas. • Analisar a interação mRNA-protéina PuF utilizando o sistema de TRI-Hibrido.

10. Método TAP-Tag (Tandem affinity purification)

11. Método TAP-tag acoplado ao DNA microarray

12. Definindo mRNA-alvos das pPuf

13. Alterações nos genes PUFs Saccharomyces cerevisiae • PUF4 e PUF5: diminuição da longevidade • PUF1: supressor de mutação em microtúbulos • PUF2 null: aumento de resistência a cicloheximida e paramomicina • Todos PUFs ausentes= células viáveis

14. pPuf1 e pPuf2 • 18 % dos genes codificam proteínas associadas à membrana em S. cerevisae. • A maior parte dos pPuf 1 e 2 associam- se a mRNAs para proteínas associadas à membrana. • Proteínas associadas à membrana: funções de transporte transmembrana e transporte vesicular de proteínas.

15. pPuf3 • Está associado à produtos gênicos mitocondrias. • 80% biossíntese de proteínas que apresenta função estruturais em ribossomos. • Entre as 22 pPuf associadas a mRNAs transcritos de mitocondrias ; 17 estão envolvidos na respiração e 12 na translocação mitocondrial.

16. pPuf4 • Associa-se ao mRNA envolvidos na síntese , processamento e maturação dos ribossomos. pPuf5 • Liga-se a frações de mRNA que codificam proteínas que participam da modificação covalente de histonas. • Liga-se a frações que codificam proteínas envolvidas na regulação da mitose.

17. Descrição das interações das pPuf com os mRNAs de levedura

18. Localização das pPuf nas células de levedura

19. Motivos consenso detectados na 3’UTR do mRNA pelas pPuf

20. Número de motivos consenso encontrados no genoma e em pPuf-alvos

21. Sistema TRI-híbrido para análise de força de interação

22. Motivos comuns detectados na 3’UTR do mRNA pelas pPuf

23. Conclusões • A ligação das RBPs (pPuf) a mRNA permite maior flexibilidade regulatória que o operon. • As RBPs demonstraram a possibilidade de se regular especificamente a localização, tradução, estabilidade e a sobrevivência do mRNA. • Muitos dos mRNAs que se ligam a RBPs codificam proteínas que são ativas em locais celulares específicos, que formam complexos e participam de vias celulares.