Plazmīdu iekšmolekulārās rekombinācijas testsistēmas konstruēšana un pielietojuma perspektīvas

1. Plazmīdu iekšmolekulārās rekombinācijas testsistēmas konstruēšana un pielietojuma perspektīvas M. Purviņa, I. Muižnieks LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

2. Rekombinācija – bioķīmisku reakciju virkne, kuras rezultātā nukleīnskābēs tiek sarautas un atkal savienotas fosfodiestersaites un notiek nukleīnskābju fragmentu apmaiņa, insercijas, delēcijas, inversijas, kā arī citi pārkārtojumi

3. Rekombinācijas tipi – • homologā rekombinācija; • sait-specifiskā rekombinācija; • nelikumīgā rekombinācija. • RecA – proteīns, kurš baktērijās nepieciešams homologās (bet ne tikai) rekombinācijas procesam

4. Darba mērķis • Izveidot testsistēmu iekšmolekulārās rekombinācijas novērošanai • Uzskaitīt rekombināciju biežumu dažādās testsistēmas plazmīdās, atkarībā no baktēriju recA gēna aktivitātes

5. Sākotnējie novērojumi • Plazmīdās, kuru struktūrā atrodami tieši nukleotīdu secības atkārtojumi, novērojama spontāna delēciju veidošanās. • Delēciju veidošanās biežumu ietekmē nukleotīdu secība starp tiešajiem atkārtojumiem. • Delēcijas notiek rekombinējot tiešo atkārtojumu secībām. • Delēciju veidošanās process ir recA atkarīgs.

6. Poliadenilēšanas signāla secības tiešo atkārtojumu veidā norobežo reportiergēna rajonu promoteru pārbaudes plazmīdās, regulējot eikariotu šūnās veidojamās mRNS transkripta struktūru

7. 1,2 – sākotnēji iegūto rekombinanto plazmīdu preparāti (no 1,5 ml) 3,4 – no klonu (1) un (2) 50 ml kultūrām attīrīta plazmīdu DNS

8. No transformantu kolonijām izdalītā plazmīdu DNS 1,2 – XL1 + GFP-Pau-Inv, lielas kolonijas; 3,4 – tas pats mazas kolonijas; 5,6 – XL1 + del-GFP; 7 – TG1 + GFP-Pau-Inv, lielas kolonijas; 8 – tas pats, maza kolonija.

9. Nukleotīdu secības, kuras sekmē delēciju veidošanos Ar GC nukleotīdu pāriem bagāti rajoni cilvēka ret onkogēna promotera PauI restrikcijas fragmentā Secības bez C un bez G nukleotīdiem plazmīdas Mph_GL0 polilinkera (MCS) rajonā

10. Plazmīdas, kurās notikušas delēcijas irmazāksuperspiralizētas Plazmīdu CCC formas Plazmīdu lineārās formas Gels, bez EthBr, krāsots pēc forēzes Gels, ar EthBr, krāsots forēzes laikā

11. Secinājumi • Plazmīdu iekšmolekulāru rekombināciju starp tiešajiem atkārtojumiem vecina secības ar nevienmērīgu nukleotīdu sadalījumu. • Plazmīdu genoma delēcijas iekšmolekulārās rekombinācijas rezultātā novērojamas replikonos ar samazinātu superspiralizācijas blīvumu.

12. pBR322 – colE1 plazmīda • Ar sarkano bultu apzīmēts ampicilīna gēns • Ar zilo bultu apzīmēts tetraciklīna gēns • Ar melno bultu apzīmēts rop rajons

13. pACYC – P1 plazmīda • tet – tetraciklīna rezistences gēns • cat – hloramfenikola rezistences gēns

14. pBR322/290 • Ar taisnstūriem norādīti tiešie atkārtojumi • Starp tiešajiem atkārtojumiem ir ieligēts MCS

15. Izaugušās kolonijas

16. No cik šūnām viena izaug ar rezistenci pret tetraciklīnu

17. Secinājumi: • Rekombinācijas starp blakusesošiem tiešajiem atkārtojumiem, atšķirībā no rekombinācijām starp atkārtojumiem, kurus šķir klonētu gēnu secības notiek neatkarīgi no recA proteīna aktivitātes. • Rekombinācijas ir atkarīgas no insertēto tiešo atkārtojumu garuma. Jo lielāks tiešo atkārtojumu garums, jo biežāk notiek delēcijas.

18. pACYC plazmīdas ir izdevīgākas iekšmolekulāro rekombināciju regulējošo faktoru pētīšanai, jo tām ir zema spontāno delēciju veidošanās aktivitāte . Zināms, ka pACYC un pBR322 superspiralizācijas blīvumi ievērojami atšķirās.

19. PALDIES PAR UZMANĪBU !