PAPÍRKROMATOGRÁFIA

1. PAPÍRKROMATOGRÁFIA Állófázis: speciális szűrőpapír, illetve erre a papírra felvitt oldószer, a cellulózon megkötött vízképezi a megosztó fázist. Mozgófázis: szerves oldószerek és vizes puffer oldatok. Mintafelvitel: mikropipetta segítségével egy papírcsík szélén lévő jelre visszük fel, beszárítjuk, majd a papírcsík végét egész szélességében az oldószerbe merítjük.

2. Ha a papírcsík az oldószert tartalmazó edényből lefelé lóg, az oldószer a papírcsíkon lefelé halad, leszálló kromatográfiának hívjuk. Ennek ellentétje a felszálló kromatográfia, ez esetben az oldószer csak a kapilláris erők hatására felfelé mozog. Kifejlesztés: • Az előrevándorló oldószer magával mossa a különböző sebességgel mozgó komponen-seket, amelyek így fokozatosan elkülönülnek egymástól. A futtatást akkor kell befejezni, mikor az oldószer a papírcsík végéhez közeledik. 

3. Felszálló módszer

4. A kapilláris jelenség egyensúlyi viszonyai Egyensúly: a görbült felület miatti nyomáscsökkenés = a folyadékoszlop hidrosztatikai nyomása.

5. Kapilláris erő h = 2γcosθ ρgr • h = folyadék oszlop magassága (m) • γ = felületi feszültség (J/m2 vagy N/m) • θ = nedvesítés szöge, meniszkusz éle és a fal közötti szög • ρ = sűrűség (kg/m3) • g = gravitációs gyorsulás (m/s2) • r = kapilláris sugár (m)

6. Kapilláris üvegcsőben a vízoszlop ma-gassága (levegőn, légköri nyomáson, 20 0C-on): • γ = 0.0728 J/m2 • θ = 20° • ρ = 1000 kg/m3 • g = 9.8 m/s2 Ha r = 1 cm  h = 1,4 mm r = 0,1 mm  h = 14 cm

7. A vegyületek papírkromatográfiás azonosí-tását (kvalitatív analízis) megkönnyíti a retenciós faktor (Rf), amely a kromatográ-fiás eljárás során a vegyület által és a mozgó fázis által megtett utak hányadosa, tehát értéke 0,00 (a vegyület a start-ponton marad) és 1,00 (a vegyület a fronton fut) között változhat. RfA = a RfB = b c c c = az oldószer által megtett út • Az Rf érték nagysága egy anyagra jellemző, bár abszolút értéke sok tényezőtől függ.

8. Oldószerek jellemzői A, Egyfázisú - vízzel korlátlanul elegyedő (metil-, etil-alkohol, aceton, piridin). B, Kétfázisú - vízzel csak korlátozottan elegyedő (butanol vízzel, vagy ecetsavval telítve). Oldószerek kiválasztásának szempontjai: Szétválasztandó anyag Rf értéke 0,10 és 0,90 között legyen. Vizsgált mintakomponens ne változzon. Megoszlási egyensúly hamar beálljon  folt alakja ne változzon a futtatás alatt. Kifejlesztés ideje 2-8 óra között legyen. Mintafelvitel: 5-20 μl mikropipettával, vagy Hamilton fecskendővel, pontszerűen a startvonalra. Beszárítás.

9. Kifejlesztés • Kromatografáló edény: • saválló, átlátszó és zárt, általában üveg. • A kifejlesztés előtt a papírt telíteni kell az oldószer gőzeivel (kb. 20% vizet köt meg és ezzel kialakul a megosztó állófázis). • Papír behelyezése a mozgófázisba. • Futtatás, amíg 1 cm-re megközelíti az oldószer-front a papír végét. • Fontos az állandó T. • Standard oldatokat együtt futtatjuk a vizsgált mintakomponensekkel – minőségi meghatározás Rf értékek alapján.

10. A front megjelölése után a kromatogramot előhívjuk. Ez rendszerint úgy történik, hogy a színreakciót előidéző reagensoldatot egy porlasz-tóval a papírra fújjuk. • Mennyiségi meghatározás: A, A foltokat kivágva és a komponenseket extrahálva spektrofotometriásan (elúciós módszer). B, A papíron levő foltokat „leolvashatjuk”: denzitométerrel (UV és látható fény); radiográfiásan (fotópapír, vagy Geiger-Müller számláló). • A papírkromatográfia felhasználási területe széles, használható szerves (növényi pigmentek, redukáló cukrok, aminosavak) és szervetlen anyagok (kationok, anionok) kimutatására. Legfőbb előnye az egyszerű és olcsó méréstechnika.

11. A klorofill-a és klorofill-b szétválasztása papírkromatográfiával

12. A klorofillok oldékonysági tulajdonságaik alapján a többi színanyagtól elkülöníthetők. A klorofill-a és klorofill-b papírkromatográfiával acetont tartalma-zó petroléterben könnyen elválasztható. A futtatás frontvonalán (a futtatószer futási magasságában) a karotinoidok sárga foltja is látható. • A klorofill-a molekula egyik metilcsoportja helyett a klorofill-b polárosabb formilcsoportot tartalmaz. A két anyag Rf értéke, színe és abszorpciós maximuma különbözik. A klorofill-a fut magasabb-ra, foltja kékeszöld, etanolos oldatának abszorpciós maximuma 660-670 nm. A klorofill-b foltja sárgás-zöld, etanolos oldatának abszorpciós maximuma 630-640 nm.

13. Fekete, lila és zöld festékek cirkuláris futtatással

14. Kromatográfiás állófázisok • Hordozólapra (üveglap, alumíniumlemez) felvitt: • Szilikagél (lsd. adszorpciós kromatográfia) • Aluminium-oxid   adszorpció • Kieselguhr – diatomaföld, mely a kova-moszatok páncéljából képződött, amorf kovasav. 70-95% SiO2, aluminium-, vas- alkáli- és alkáliföldfém-oxidok. • Magnézium-szilikátok - Florisil • Cellulóz (lsd. megoszlási kromatográfia, papírkromatográfia)  megoszlás

15. Kromatográfiás állófázisok • Módosított szilikagél (lsd. nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia - HPLC): • - fordított krom. (RP-8, RP-18)  megoszlás • - normál krom. (DIOL, CN)  megoszlás • Ioncserélők (lsd. Ioncsere kromatográfia)  ioncsere CM-cellulóz, DEAE-cellulóz kémiailag kötött fázisok

16. Kromatográfiás állófázisok • Gélkromatográfiás anyagok – méretkizárásos kromatográfia Dextrán gélek – Sephadex G (részecskeméret 10-40 μm) Poliakrilamid – BioGel P

17. Szilikagél Kötőanyaggal Kötőanyag nélkül(H) 5-10% gipsz (G) Makropórusos 3% keményítő változatát gélszű- résre használják. Fajlagos felület: 300 – 600 m2/g Átlagos pórusátmérő: 40 – 150 Å Stabilitás: 1-8 pH

18. Szilikagél felülete Víz molekulát adszorbeált szilanolcsoportok H H H-hídas szilanol csoportok O Szabad szilanol csoportok H H H H OH O O O O OH Si Si Si Si Si Si O O O O O O • A víz jelenléte csökkenti az elválasztás hatékonyságát.

20. Impregnált rétegek • Ezüst-nitrát Telítetlen vegyületek kettős kötéseivel kialakított π komplexek: Cisz-transz vegyületek elválasztása. Telített, telítetlen vegyületek elválasztásának fokozása. • Borát vegyületek Vicinális hidroxil csoportokat tartalmazó vegyüle-tekkel komplex képzés. • Koffein PAH

21. Mozgófázis • Vizes pufferek és szerves oldószerek, valamint oldószer-keverékek (lsd. eluotróp sor). • Kapilláris erők mozgatják az eluenst (lsd. papírkro-matogr.). • Kifejlesztés ideje függ: - rétegvastagság; - szorbens szemcse jellemzői (méret, alak, stb.); - kromatografáló kád légtere; - lemez térbeli helyzete; - oldószer minősége (sűrűség). • Futtatási körülmények optimálására használják a Stahl- féle PRIZMA módszert.

22. Mintafelvitel

24. Thin Layer Chromatography (TLC) sajátságai Állófázis Mozgó fázis 1, Egyensúlyi viszonyok Minta komponensek Gőzfázis

25. 1, A gőztér szerepe: • A gőztér komponensei lecsapódnak a rétegre és előnedvesítik a szorbenst, az aktív adszorpciós helyeket dezaktíválják. • Az oldószer és a réteg között nem ugyanaz az egyensúly, mint az oldószer gőzök és a réteg között! Raoult törvénye alapján • A gőztér kondenzálása telített kádból gyorsabb, ez gyorsabb futtatást tesz lehetővé.

26. TLC és HPLC • A mozgófázis frontja ( α front) „száraz” álló-fázison halad előre ↔ HPLC • A szeparálodott komponenseket nyitott lemezen kapjuk, színes anyagok közvetlenül láthatók, könnyen archiválható ↔ HPLC • Egyszerre több minta és standard futtatható (60-70 db), azonos körülmények között ↔ HPLC • Álló- és mozgófázis (UV elnyelése megengedett ↔HPLC) szelektivítása egyaránt változtatható → HPLC

27. Elválasztási módszerek 1, Egy dimenziós • Leszálló - Sephadex géleknél, mivel itt nincs kapillarítás. • Felszálló - leggyakrabban használt, függőleges, vagy döntött réteg. • Kör 2, Sokszorozó = lépésenkénti gradiens fejlesztés 3, Két- és sok dimenziós (planar chromatography = PC) • Széleskörű 2D PC (PCxPC) • Szelektív 2D PC (PC+PC) • Kapcsolt rétegű PC (PC-PC)

28. PCxPC

29. PC+PC

30. PC-PC

31. NagyhatékonyságúVékonyréteg Kromatográfia High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) • Finomszemcsésrétegen, rövid futási távolságra, gyors és hatékony elválasztást tesz lehetővé. Kifejlesztési távolság (cm) Kifejlesztési idő (perc)

32. Szempontok TLC HPTLC Szorbens vastagság 0,25 mm 0,10 mm Szemcseméret 10-15 um 5-7 um Elválasztási úthossz 10-15 cm 3-7 cm Rétegméret 20x20 cm 10x10 cm Vékonyréteg Kromatográfia (TLC)ésNagyhatékonyságúVékonyréteg Kromatográfia (HPTLC) összehasonlítása Elválasztás időtartama 30-200 perc 3-20 perc

33. Rétegkromatogramok előhívása • Fizikai módszerek: UV fényben (254 és 366 nm) saját abszorpciójuk, vagy a háttérfluoreszcencia kioltása révén (fluoreszcens kioltás) sötét foltként detektálhatók (körbe rajzolás módszere). • Minőségi jellemzés az Rf értékekkel (azonos körülmények között  ΔRf =  2%. • Mennyiségi jellemzés (direkt, vagy indirekt lsd eluciós): • Denzitometriásan (abszorbancia, fluoreszcencia); • autoradiográfiásan (radioaktív jelölés).

34. Rétegkromatogramok előhívása • Kémiai módszerek: • speciális kémiai reakciókkal (színes termék keletkezésével); • Pl. aminosav-ninhidrin, lipid-jódgőz, szerves anyag-kénsav. • Biológiai módszerek: • speciális mikroorganizmusokkal.

35. Növényi pigmentek TLC elválasztása Futattószer: petroléter, aceton Kieselgel 60 F254

36. Aminosavak TLC elválasztása • A hazai kutatások eredményeként kialakított, kati-oncserélő tulajdonságú Fixion 50 x 8 vékonyréteg alkalmas az aminosavak elválasztására. • A Fixion-50 x 8 kovalensen kötött karboxilcsopor-tokat tartalmazó kationcserélő gyanta, tehát rajta az aminosavak a startponttól a kromatogram kifej-lesztéséhez használt citrát pufferben annál maga-sabbra futnak, minél inkább savas a karakterük. • Az aminosavak minőségi azonosítása a standardként használt aminosavak egyidejű futtatása után az Rf (retenciós faktor) számításával történik. Rf = minta vándorlási távolsága (cm) oldószerfront távolsága (cm)

37. Előhívás ninhidrin reagenssel (lsd. Ioncserés kromatográfia)

38. Cukrok elválasztása vékonyrétegkromatográfiával Szilikagél vékonyrétegen ( Kieselgel 60 F 254 5 x 10 cm-es lemez) lehetőség van egyes szénhidrátok elválasztására. Az elválasztáshoz acetonitril : víz = 87 : 15 arányú keveréke alkalmazható. A minták specifikus reagenssel, a difenil-amin-anilin-foszforsavval elő-hívva, az egyes komponensek láthatóvá tehetők. Ezzel a módszerrel kb. 15 szénhidrát elválasztására van lehetőség.

39. dezoxiribóz • ribóz • xilóz • arabinóz • szorbóz • fruktóz futtatási irány • glükóz • galaktóz • szacharóz • maltóz • cellobióz • melibióz • raffinóz

41. Vékonyrétegkromatográfia alkalmazása Előnyei: • Szimultán (nagyszámú > 20) minta- és standard futtatása • Gyors és olcsó, könnyen kivitelezhető • Kis mennyiségű oldószer használat HPTLC  HPLC • Álló- és mozgófázis szelektivítása egyaránt változtatható.

42. Alkalmazási területek • Tisztaságvizsgálat (gyártásközi - gyógyszeripar) • Kémiai reakciók nyomon követése • Előtanulmány a HPLC mérésekhez • Preparatív elválasztás - 0,1-1 g anyag, sávos mintafelvitel, elúciós (indirekt) detektálás.

43. KROMATOGRÁFIÁS FOGALMAK DEFINICIÓJA • RETENCIÓS IDŐ (tR) • Az az idő, mely a minta adagolásától az adott alkotónak a detektorban maximális koncentrációban való meg-jelenéséig eltelik. • HOLT IDŐ (t0) • Az inert eluens rendszeren való áthaladásához szükséges idő. • REDUKÁLT RETENCIÓS IDŐ (t’R) t’R = tR-t0 • RETENCIÓS TÉRFOGAT (VR) VR = tRF F = eluens térfogati áramlási sebessége (ml/min)

44. Redukált retenciós idő t’R = tR(retenciós idő)-t0(holt idő)

45. Elválasztás hajtóerje: μi,s # μi,m s = állófázis, m = mozgó fázis • Kváziegyensúly jellemzése: Ki = ci,sci = mimi = niMi ci,m V Ki = ni,sMiVm = kiVm ni,mMiVs Vs ki = i-edik alkotó retenciós tényezője (kapacítás faktor) Vm = mozgófázis térfogata Vs = állófázis térfogata

46. FÁZISARÁNY (β) β = Vm Vs Ki= kiβ ki = ni,s = tR,i - t0 = t’Ri ni,m t0 t0 • Ideális elválasztás: 1 < ki < 5 • SZELEKTIVITÁSI TÉNYEZŐ (α) α = K2 = k2= t’R2 K1 k1 t’R1 α › 1,05, feltéve, hogy t’R2 > t’R1

47. A szelektivitási tényezőt az álló- és mozgó fázis anyagi minősége, összetétele és az elválasztás hőmérséklete határozza meg elsődlegesen. Ezek változtatásának döntő befolyása van a felbontásra! A retenciós tényezőt az állófázis filmvastag-ságával tudjuk növelni (Vs!), ennek hatása azonban nem jelentős.

48. TÁNYÉRELMÉLET • Az elválasztás akkor hatékony, ha a csúcsok szélessége nagyon kicsi → ezt jellemezzük az ELMÉLETI TÁNYÉR-SZÁMMAL: N = tR 2 = 16 tR2 σω • Minél nagyobb N, annál hatékonyabb az elválasztás N = 103 - 105 • N növelhető: - oszlophossz↑; - szemcseméret↓; - hőmérséklet↑; - belső átmérő↓; - áramlási sebesség↓↑.

49. Gauss görbe alakú elúciós görbe tR 2σ Félérték szélesség ω = 4 σ

50. ELMÉLETI TÁNYÉRMAGASSÁG (H) H = L = Lω 2 L = oszlophossz N 16 tRω/ tR = relatív csúcsszélesség Minél kisebb H, annál hatékonyabb az elválasztás. FELBONTÓKÉPESSÉG (Rs) Rs = tR2 - tR1 = 2 (tR2 - tR1)≥ 1,5 2 (σ2 + σ1)ω2 + ω1 Rs = √N (α-1)k 4 α (1+k)