1 / 69

Replikacja u Eukaryota

Replikacja u Eukaryota. Proces replikacji u Eukaryota przebiega bardzo podobnie do replikacji w komórkach bakteryjnych. Zasadniczą różnicą jest istnienie wielu ori .

gilon
Download Presentation

Replikacja u Eukaryota

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Replikacja u Eukaryota Proces replikacji u Eukaryota przebiega bardzo podobnie do replikacji w komórkach bakteryjnych. Zasadniczą różnicą jest istnienie wielu ori. U drożdży podobnie jak u bakterii ori (nazywane tu ARS od ang. autonomouslyreplicatingsequence) zawiera sekwencje bogate w A i T: [A/T]TTTAT[A/G]TTT[A/T]

  2. U człowieka jest ok. 30 000 ori. Znajdują się co 30 – 300 kpz. NIE SĄ DOBRZE ZDEFINIOWANE Komputerowa analiza wielu potencjalnych ori pozwoliła na zaproponowanie takiej sekwencji konsensusowej: WAWTTDDWWWDHWGWHMAWTT gdzie: W = A lub T; D = A lub G; H = A lub T lub C; M = A lub C.

  3. Jak można badać replikację u Eukaryota? Replikacja w układzie bezkomórkowym – replikacja wirusów DNA np. wirusa SV40 (małpi wirus)lub wirusa brodawczakabydlęcego (papilloma). Wyłączanie aktywności niektórych białek przez przeciwciała Model drożdżowy – badanie mutantów

  4. Inicjacja replikacji: • Do ori przyłącza się kompleks ORC złożony z 6 białek (o m. cz. ~100, 82, 66, 50, 50, 28 kDa) • ORC – (ang. origin of replicationcomplex) • ORC pełni tę samą funkcję co DnaA u bakterii Następnie helikazarozplatahelisę, a polimeraza a syntetyzuje startery na nici wiodącej i opóźnionej. Funkcję helikazy pełni kompleks białek MCM 2-7 (ang. minichromosomemaintenance) = DNA replicationlicencingfactors (tzw. czynniki upoważniające).

  5. POLIMERAZAa Składa się z czterech podjednostek: Podjednostka 180kDa– aktywnośćpolimerazy DNA Podjednostki55kDa i 48 kDa– tworząrazem prymazę (polimeraza RNA). Podjednostka 68kDaspaja kompleks a może mieć też znaczenie regulatorowe (ulega fosforylacji). Syntetyzuje startery złożone z 10 nukleotydów RNA (prymaza) i 20-30 nukleotydów DNA (polimeraza) NIE MA AKTYWNOŚCI EGZONUKLEAZY

  6. POLIMERAZY d oraz e • Głównymi polimerazami replikacyjnymiEukaryota są polimerazy delta i epsilon (d i e). • Polimerazy d i e są złożone z 4 podjednostek o różnych masach cząsteczkowych: • - (p125, p66, p50, p12) • e - (p256, p80, p23, p22) • Największe podjednostki obu polimeraz zawierają zarówno aktywność polimerazy jak i 3’-5’ egzonukleazy. • Polimeraza d odpowiada za replikację nici opóźnionej • Polimeraza e odpowiada za replikację nici wiodącej Uwaga! W podręczniku „Zarys biochemii” jest informacja nieaktualna!

  7. Analogicznie do Prokaryota – polimeraza replikacyjna musi oddziaływać ze strukturą, która będzie zwiększać jej kontakt z DNA, będzie zwiększać jej procesywność. Tą strukturą u Eukaryota jest PCNA(ang. proliferatingcellnuclearantigen), antygen jądrowy proliferujących komórek. Trimer PCNA 3 x 29 kDa Oddziaływanie PCNA z DNA i kompleksem polimerazy reguluje RFC (replikacyjny czynnik C)

  8. W trakcie syntezy nici opóźnionej: Synteza fragmentu Okazaki zostaje zatrzymana, gdy polimeraza dnapotka starter poprzedniego fragmentu Okazaki. Wtedy następuje usunięcie tego startera przez działanie dwóch enzymów: Dna2 (DNA helikaza/endonukleaza 2) oraz endonukleazęFen-1 (Flap endonuclease). Luka zostaje wypełniona przez polimerazę d. U EUKARYOTA NIE MA WIĘC ODPOWIEDNIKA PROKARIOTYCZNEJ POLIMERAZY I

  9. ORC (ang. origin of replication complex); PCNA (ang. proliferating cell nuclear antigen); antygen jądrowy proliferującychkomórek RFC (ang. replicationfactor C); replikacyjny czynnik C RPA (ang. replication protein A); replikacyjnebiałko A MCM (ang. minichromosome maintenance)

  10. Przykłady polimeraz DNA u ssaków

  11. Polimerazy eta oraz iota należą do rodziny Y polimeraz DNA. Uczestniczą w tzw. „translesion DNA synthesis (TLS)” ang. lesion = rana, uszkodzenie To są bardzo ciekawe polimerazy. Pracują na matrycy, ale nie dbają zbytnio o wierność replikacji. Dzięki temu mogą prowadzić replikację nawet wtedy, gdy matryca zawiera błędy (polimeraza d w tej sytuacji nie jest w stanie włączać nukleotydów do łańcucha DNA). Błędy wprowadzane przez polimerazy Y są później naprawiane przez różne systemy naprawy DNA.

  12. Polka współodkrywcą elementu mechanizmu naprawy DNA PAP, 2006-01-13 24-letnia Polka kierowała międzynarodowym projektem badawczym, w ramach którego dokonano bardzo ważnego odkrycia w dziedzinie biologii molekularnej - ustalono nieznany wcześniej element jednego z podstawowych mechanizmów naprawy uszkodzonego DNA. Science16,December 2005:Vol. 310. no. 5755, pp. 1821 – 1824 Ubiquitin-Binding Domains in Y-Family Polymerases Regulate TranslesionSynthesis MarzenaBienko, Catherine M. Green, Nicola Crosetto, Fabian Rudolf, GrzegorzZapart, Barry Coull, Patricia Kannouche, Gerhard Wider, Matthias Peter, Alan R. Lehmann, Kay Hofmann, Ivan Dikic

  13. Jak może się skończyć synteza nici opóźnionej w liniowych chromosomach?

  14. 5’ koniec nowo syntetyzowanego DNA jest zawsze krótszy od macierzystego DNA • W nowej cząsteczce DNA fragment 3’ końca jest jednoniciowy (pojedyncza nić to 50 – 400 n) • DWA PROBLEMY • Jednoniciowy DNA jest bardzo podatny na degradację • Przy każdym podziale komórkowym chromosomy ulegałyby (ulegają) skróceniu

  15. NAGRODA NOBLA 2009 w dziedzinie medycyny i fizjologii Elizabeth H. Blackburn Carol W. Greider Jack W. Szostak

  16. Telomery tworzą duże dwuniciowe pętle TRF2 (ang. telomericrepeatbindingfactor 2) Obecnie wiadomo, że kompleks w skład, którego wchodzi TRF2 ma skomplikowaną strukturę

  17. ten kompleks nazywa się z ang. shelterin

  18. Jak może się skończyć synteza nici opóźnionej w liniowych chromosomach? Dzięki specyficznej budowie końców chromosomów – telomerów i enzymowi – telomerazie. DNA telomerów zawiera setki powtórzeń krótkich sekwencji bogatych w guanylan. Np. Tetrahymena (Orzęsek): GGGTTG Caenorhabditis (Nicień): GGCTTA Człowiek: GGGTTA 5’..... GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA-3’ 3’......CCCAATCCCAAT-5’

  19. www.bccrc.ca/tfl/people_plansdor.html FISH fluorescent in situ hybridization Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

  20. 5’..... GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA-3’ 3’......CCCAATCCCAAT-5’ 10 000 par zasad 400 zasad długość telomeru długość odcinka jednoniciowego Bioorganic and MedicinalChemistry, 17, 5, 2009, 1870-1875

  21. TELOMERAZA – rybonukleoproteina Enzym o aktywności odwrotnej transkryptazy (ang. telomerasereversetranscriptase) U człowieka: TERT + odcinek RNA (TERC) + 8 białek pomocniczych

  22. RNA telomerazy orzęska

  23. Etapy: • przyłączenie telomerazy do telomeru • wydłużenie końca 3' (nić macierzysta) przez telomerazę - synteza DNA na matrycy RNA • wydłużenie nici opóźnionej przez polimerazę DNA - synteza DNA na matrycy DNA Telomeraza każdorazowo dodaje wiele powtórzeń charakterystycznej sekwencji telomerowej.

  24. Hipoteza – skracanie telomerów warunkuje proces starzenia się? • Czy długość telomerów determinuje długość życia? • Porównując gatunki – NIE (mysz - długie telomery, człowiek – krótkie telomery) • Czy ma wpływ na długość życia osobników w obrębie gatunku – NIE WIADOMO

  25. W wielu tkankach wraz z wiekem osobniczym dochodzi do skracania telomerów. Im człowiek starszy, tym ma krótsze telomery. Co z tego wynika? NIC Równoległe zachodzenie 2 procesów nie determinuje zależności między nimi. Nie wiadomo, czy istnieje jakaś zależność, a jeśli tak, to który proces jest przyczyną, a który skutkiem. Np. starzenie i siwienie i zmarszczki. Czy można powiedzieć, że starzenie jest rezultatem siwienia i pojawiania się zmarszczek?

  26. W hodowlach komórkowych istnieje zależność między aktywnością telomerazy a zdolnością komórek do proliferacji. Normalne komórki wykazują ograniczoną zdolność do podziałów. Po pewnej liczbie podziałów przestają proliferować – starzenie komórkowe.

  27. Wiele tkanek dorosłego człowieka zachowuje aktywność telomerazy. Jakie to tkanki? • Te, które muszą intensywnie proliferować: • Komórki warstwy podstawnej naskórka • Komórki nabłonka jelit • Aktywowane limfocyty • Komórki warstwy podstawnej endometrium (błony śluzowej macicy) (zależnie od fazy cyklu miesięcznego) • Komórki mieszka włosowego

  28. Telomeraza i nowotwory Aktywność telomerazy nie stymuluje nowotworzenia jednak Krótkie telomery i brak aktywności telomerazy mogą hamować rozwój nowotworów. Podczas nowotworzenia, po serii podziałów komórkowych zmutowane komórki nie mogą dalej się dzielić, chyba, że zostanie przywrócona ekspresja telomerazy lub uruchomiony inny mechanizm wydłużania telomerów. Wiele – ale nie wszystkie! – nowotwory mają aktywność telomerazy.

  29. USZKODZENIA I NAPRAWA DNA

  30. Część mutacji może powstawać w wyniku błędów podczas replikacji Część może powstawać w wyniku modyfikacji chemicznych

  31. Jak może dojść do powstania substytucji Formy tautomeryczne zasad azotowych adenina forma iminowa adeniny tymina forma enolowa tyminy

  32. Formy tautomeryczne: iminowa i enolowa występują rzadko - 1:10 000 nukleotydów. Mogą (nie muszą) tworzyć pary niestandardowe:

  33. Niestandardowe pary zasad enol-T – G enol-G – T imino-A – C imino-C – A Karcynogen - 5 bromodeoksyurydyna (BrdU) jest analogiem tymidyny. Znacznie częściej niż tymidyna przyjmuje konformację enolową – częściej dochodzi do substytucji

  34. A–T A – BrdU enol-BrdU – G G – C podział 1 podział 2 podział 3 WNIOSEK: Tautomeryzacje mogą prowadzić do tranzycji

  35. Przyjęcie konformacji „syn” przez purynę umożliwia zajście transwersji. Może np. powstać para pomiędzy izomerami adenylanu: syn, amino-A : anty,imino- A

  36. Polimeraza może popełniać błędy w wyniku „poślizgu na matrycy” (ang. slippageerrors). Może dodawać nukleotydy zwłaszcza w miejscach tandemowych powtórzeń • W wyniku wypętlenia fragmentu DNA może dojść do pominięcia tego fragmentu przy replikacji (delecja). • Szereg chorób o podłożu genetycznym jest związanych z wydłużaniem sekwencji repetytywnych (tandemowych). • Klasyczny przykład:choroba Huntingtona (w białkuhuntingtinie trójka CAG kodująca glutaminę, 10-30 powtórzeń – norma; powyżej 35 - choroba)

  37. Chemiczne modyfikacje zasad azotowych: Utlenianie Alkilacja Utlenianie adeniny i cytozyny: -NH2 =O cytozyna uracyl (może zachodzić w normalnych warunkach) adenina hipoksantyna (w DNA kompl. z C) Utlenienie grup aminowych adeniny i cytozyny może prowadzić do mutacji. guanina ksantyna (kompl. z C) Brak mutacji Typowym utleniaczem zasad azotowych jest HNO2.

  38. Utlenianie przez reaktywne formy tlenu (RFT) może prowadzić do utworzenia 8-oksyguanylanu. 8-oksyguanozyna Utlenienie guanylanu do 8-oksyguanylanu może prowadzić do transwersji: G T , gdyż 8-oxG może tworzyć parę z A.

  39. Utlenianie C do U zachodzi dość często. W toku ewolucji wykształcił się specjalny mechanizm naprawy rozpoznający U w DNA. • Może jednak dojść do metylacji U (do tyminy) i wówczas mutacja pozostaje niezauważona.

  40. U kręgowców i roślin główną metylotransferazą DNA jest enzym rozpoznający CpG i metylujący cytozynę. • Utlenianie 5-metylo-C do tyminy powoduje tranzycję C:G do T:A podczas kolejnych replikacji. Jest to najczęstsza mutacja u człowieka.

  41. Podsumowanie: Utlenienie C do U - zauważone bo U jest nietypowe dla DNA – możliwość naprawy (chyba, że zanim U zostanie „odkryte” ulegnie metylacji) Utlenienie 5-metylo-C do T – niezauważone bo T jest typowe dla DNA – brak możliwości naprawy W wyniku tego, że DNA ulega metylacji przy C5 cytozyny i ze względu na to, że utlenienie 5-metylocytozyny pozostaje niezauważone, w toku ewolucji ilość par CpG w genomach kręgowców uległa znacznemu obniżeniu.

  42. Częstość występowania sekwencji CpG: Prokaryota:1/16 nukleotydów (zgodnie z rachunkiem prawdopodobieństwa) Eukaryota:1/50 nukleotydów Metylacja C w parach CpG: Prokaryota: 5% Eukaryota: 70-90% Ciekawostka: Dzięki temu - w toku ewolucji sekwencje oligonukleotydowe zawierające niemetylowane CpG stały się jednymi z sygnałów zagrożenia rozpoznawanymi przez układ odpornościowy (przez receptory TLR)

  43. CZŁOWIEK: GGCTTTTGCCTGGGGTTCTCAGGAGGGGAGAGTTGGGAGAGGCTTTGCTGCTGAGGAAATTTATTTGGTAGATTGAAGGTTTGAACGAGAGCTACAGAAACGAAAGAAAAAGTCTGTATAAGCCAATGGTGTTCGGGAAGAAAATAACCCCATTGCCTTGAGTTTGTAGGTGCCACTACTACTCTGGAAAAATGGCAGATGACGAAGACTATGAGGAGGTGGTGGAGTACTACACAGAAGAAGTGGTTTA CGAAGAGGTGCCGGGAGAGACAATAACAAAAATTTATGAGACTACGACAACAAGGACATCTGACTATGAGCAATCAGAAACTTCCAAACCAGCTCTGGCA  350 nukleotydów / 7 CpG = 50 E.coli TAGTTCTTAACGCCGATACCACATTCCATACCGTTACGGACTTCGTTAA CGTCATCTTTGAAGCGGAGCAGGGACTCCAGCTCGCCTTCGTAGATAACCACGTTGTCACGCAGAACGGGGATCGGGTTGTGACGTTTAACCACACCTTCGGTAACCATACAGCCTGCGATGGCACCAAATTTCGGCGATTTGAACACGTCACGAACTTCCGCCAGACCGATAATCTGCTGTTTCAGTTCCGGAGACAGCATACCGCTCATCGCTGCTTTCACTTCGTCAATCAGGTTATAGATGA CGGAGTAGTAACGCAGATCCAGGCTTTCCGCTTCAATCACTTTACGTGCA 350 nukleotydów / 29 CpG = 12

  44. ZADANIE DOMOWE: Sprawdź czy podany przykład to reguła czy wyjątek Wybierz 3 dowolne (dość długie) fragmenty z genomu kręgowca – sprawdź ilość CpG Dla porównania – sprawdź częstość występowania CpG u bakterii

More Related