I) Obtention de l’ADN recombinant

1. I) Obtention de l’ADN recombinant VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplicationautonome) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADNd'intérêt Insertion du fragment d'intérêtdans levecteur Obtention d'un ADNRecombinant 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu

2. 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :Transformation des bactéries 4) Étalementsurboîte (pour la sélection) 1) Mélange de plasmides et de bactériescompétentessur glace (les bactériescompétentesontététraitées pour faciliterl'entréed'ADN : leurparoi a étéfragilisée par un traitement au chlorure de calcium) (utilisation de Escherichia coli en général : utilisation facile, croissancerapide) 3) Ajout de milieu nutritif aux bactéries, croissance 1h à 37°C (cela permet l'expression des protéines de résistance aux antibiotiques pour la sélection ultérieure) 2) Choc thermique à 42°C : les plasmides vont pénétrer dans les bactéries

3. 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :Sélection des bactéries transformées Il faut sélectionner les bactéries transformées (celles comportant le plasmide recombiné) Colonie de bactéries transformées Étalement des bactériessuruneboîtecontenant un milieu gélosé et un antibiotique : seules les bactériestransforméespourront se multiplier car le plasmideporte un gène de résistance contrel'antibiotique Mélange debactéries transformées contenant le plasmide d'intérêt et de bactéries non transformées

4. 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :Extraction du plasmide recombiné Ensemencement d’une colonie de bactéries transformées dans du milieu liquide + antibiotique une nuit à 37°C => Multiplication des bactéries et donc amplification du nombre de plasmides recombinés (cf. présence d'une origine de réplication bactérienne sur le plasmide, l'antibiotique assure une pression de sélection pour que les bactéries conservent le plasmide) Il faut ensuite récupérer le plasmide

5. 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :Extraction du plasmide recombiné Les bactéries sont lysées par un détergent en milieu alcalin afin de libérer l'ADN génomique et plasmidique. L'ADN génomique et les protéines sont précipités par de l'acétate de sodium. Le précipité est séparé par centrifugation, le surnageant contient l'ADN plasmidique. L'ADN plasmidique est alors précipité (volume double d'éthanol ou isopropanol), lavé puis redissous dans un tampon adéquat. Cette étape peut être réalisée avec des colonnes de purification d’ADN.

6. I) Obtention de l’ADN recombinant VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplicationautonome) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADNd'intérêt Les bactéries poussant sur le milieu+antibiotique possèdent un plasmide avec le gène de résistance à l’antibiotique. Mais ce plasmide contient-il l’insert cloné ? Il peut y avoir religation du vecteur sur lui-même. Nécessité d’un crible pour trouver les clones positifs ayant intégré l’ADN à cloner. Insertion du fragment d'intérêtdans levecteur Obtention d'un ADNRecombinant amplifié 6 ) Vérification de la construction

7. 6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR Les bactériestransforméespeuventcontenirle plasmiderecombiné (contenantl'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteurrefermésurlui-même (2) => ilfautdistinguercesdeux populations 2 1 PCR avec les amorcesayantservi à l'obtention de l'insert, observation des produitsforméssur gel d'agarose

8. 6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR Les bactériestransforméespeuventcontenir le plasmiderecombiné (contenantl'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteurrefermésurlui-même (2) => ilfautdistinguercesdeux populations (1) (2) PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des produits formés sur gel d'agarose : Résultats du gel d’agarose : Aucunproduitdétecté pour le vecteurseul (2), mais un produit visible pour le plasmiderecombiné (1)

9. 2 6 ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction Digestion enzymatiquepar une enzyme avec un site présentdansl'insert et un seul site dans le vecteur : 1 (ex : MscI)

10. 6 ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction (1) (2) Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans l'insert et un seul site dans le vecteur puis Analyse des produits de restriction sur gel d'agarose On obtient des cartes de restriction différentes : uneseulecoupure et doncuneseulebande pour le vecteurseul (2), deuxcoupures et doncdeuxbandes pour le plasmiderecombiné (1)

11. 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger Désoxyribose : formation possible d'une liaison phosphoester (élongation de la chaînesynthétisée) ADN de séquenceinconnue, à séquencer ADN de séquenceconnue 5’-P-polynucléotide Synthèse du brin complémentaire par une ADN polymérase Choixd'uneamorce P nucléotide La synthèse du brincomplémentaireestfaite en présence de nucléotides désoxyribose, 5’-P-polynucléotide Et de nucléotides didésoxyribose. Didésoxyribose : formation d'une liaison phosphoester impossible, blocage de l'élongation de la chaînesynthétisée P nucléotide

12. 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger • Réaction de synthèse du brincomplémentaire de l'ADN à séquencer à partird'uneamorce, et en présence de nucléotides et d'un didésoxynucléotide => formation de fragments de différentestailles, dont la synthèseestbloquée au niveau du didésoxynucléotide intégré : ADN à séquencer A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A 3' 5' ddT T-A-ddT T-A-T-C-G-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT 5' amorce Brins formés en présence de didésoxy-thymine (ddT) dans le milieu réactionnel 5' 5' 5' 5' 5'

13. 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger • Les didésoxynucléotidessontmarqués : radioactivitéou fluorescence. • Analyse des différentsbrinsforméssurgel ultra-résolutif(détectiond'unedifférence d'un nucléotide) 6 ddT 1 T-A-ddT 2 T-A-T-C-G-ddT 3 T-A-T-C-G-T-A-A-ddT 4 T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT 5 T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT 6 5' 5 5' 4 5' 3 5' 5' 2 5' 1

14. 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger ADN à séquencer : 3' A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A Lecture du brincomplémentaire : ddT ddA ddG ddC 5' T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-T Une réaction de synthèse différente pour chacun des didésoxynucléotides, analyse sur gel pour chaque réaction, lecture du brin complémentaire(en partant des plus petits fragments vers les plus gros) 4 3 2 1

15. 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Automatisation du séquençage ADN à séquencer : 3'C-A-G-A-A-T-T-G-C-A-G-A-G-T Lecture du brincomplémentaire : 5'G-T-C-T-T-A-A-C-G-T-C-T-C-A Automatisation des résultats de séquençage : les didésoxynucléotidessontmarqués avec des fluorescencesdifférentes, celapermet de faire uneseuleréaction et uneseule lecture. Le séquenceurdétecte la fluorescence et repère la taille des fragments d'ADN. On obtient des courbes de fluorescences qui sontinterprétées en terme de nucléotides avec un indice de confiance (icibarreverte : confiance maximum)