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红曲中桔霉素的分析检测. 报告人：徐国亮 080300116. 桔霉素的理化性质. 桔霉素含一个羧基 , 有两种形式 : 离子态和非离子态 ( 羧基和相邻的酮基及羟基形成分子内氢键 ) , 其分子式为 C 13 H 14 O 5 , 分子量 250 。在无水乙醇或苯 - 环己烷中结晶呈柠檬黄针状结晶 , 溶点 : 175 ℃ 。溶于极性有机溶剂，溶于氢氧化钠，碳酸钠和碳酸氢钠稀溶液 . 难溶于水。. 桔霉素的化学性质.
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红曲中桔霉素的分析检测 报告人：徐国亮 080300116
桔霉素的理化性质 桔霉素含一个羧基, 有两种形式: 离子态和非离子态(羧基和相邻的酮基及羟基形成分子内氢键) ,其分子式为C13H14O5 , 分子量250。在无水乙醇或苯- 环己烷中结晶呈柠檬黄针状结晶, 溶点: 175 ℃。溶于极性有机溶剂，溶于氢氧化钠，碳酸钠和碳酸氢钠稀溶液.难溶于水。
桔霉素的化学性质 红曲色素能够与FeCl3、Br2、KMnO4反应，呈阳性，溶于95%的乙醇呈黄色，加H2O2后褪色，然后变浅褐色，加入0.1MH2SO4变成橙黄色，在加0.2MNaOH又恢复酒红色。
在红曲霉培养时,首先由一个乙酰辅酶A 分子和四个丙二酰辅酶A 分子缩合成戊酮,然后分经两条途径:一条途径是此戊酮再与丙二酰辅酶A 分子缩合成己酮,最后生成红曲色素；另一途径是此戊酮经甲基化、缩合、还原、烷基化、还原、氧化、脱水等步骤,最后生成桔霉素。 桔霉素的处理方法：1)加热处理；2)氧化处理；3)微波处理。 桔霉素的形成机理
红曲色素的分析检测方法 抑菌圈法 双向薄层层析 高效液相色谱HPLC 酶联免疫法ELISA
抑菌圈法 抑菌圈法比较简单和直接，可间接定性和半定量确定红曲中桔霉素含量，但红曲中的抗菌物质不止桔霉素一种，而且影响因素很多，因此不够准确。
双向薄层层析 1.制板 硅胶加水调成糊状,均匀铺在 玻璃板上(20 cm×20 cm) , 自然干燥后于105 ℃活化1 h , 放于干燥器中待用。 2.桔霉素标准溶液制备 准确称量1 mg 桔霉素标准品, 用乙醇定容至10 ml ,于4 ℃低 温保藏 3.待测样制备 红曲样品用70 %乙醇浸泡12 h, 离心,过滤。留上清液, 低温保藏,备用
双向薄层层析 4.点样 用微量注射器按需要量将标 准品和待测样品分别点在 适当位置,一般点样量不应 超过10μl ,样圈直径不超过5mm 5.展开 将展开剂按比例混合加入层析缸, 展开剂 的量以淹没薄板8～10 mm为宜。第一相 展开结束后,取出薄板放置一段时间, 使 展开剂自然挥发。进行第二相展开。 6.紫外检测 将展开后的薄板,挥发至干。 于紫外灯下进行观察。
展开剂 第一相分离红曲中除桔霉素外的其他成分,第二相主要分离桔霉素。采用这种方法可避免其他成分对桔霉素荧光点的视觉干扰。实验结果表明,利用双向展开法,可以检测出红曲中的桔霉素。 具体展开相, 第一相点标准品及样品, 展开剂选择氯仿∶丙酮(9∶1) 。第二相侧向展开, 展开剂选用苯∶乙酸乙酯∶甲酸(6∶3∶1),展开结束,晾干。在紫外灯下可见清晰的绿色荧光。根据第二相展开的Rf 值可确定为桔霉素。
双向薄层层析 流程 1.制板 2.标准 液制备 第 一 相 洗 脱 液 3.待测 样制备 4.点样 5.展开 第 二 相 洗 脱 液 6.紫外 检测
红曲样品双向展开示意图 第二相 第 一 相
高效液相色谱法 高效液相色谱法能精确测定红曲中桔霉素含量，采用紫外检测器，需对样品进行预处理和板层析，最低检测浓度为１mg/L；采用荧光检测器，由于桔霉素本身具有在激发态下产生荧光的特性，而其它色素在这一波长范围内不具备激发荧光的条件，因而不需对样品进行预处理，桔霉素的测定也不受干扰，检测结果的重现性好。
各国的桔霉素检测方法 香港中文大学Hin-chung Wang等采用先 酸化沉淀，将滤出液冷冻干燥后再相继用 95%的乙醇和乙酸乙酯萃取，蒸干后溶于 苯，用色谱柱分离，收集相关部分进行 TLC分析 法国科学家Blanc采用氯仿(或乙酸乙酯）从 酸化后的培养液中萃取桔霉素，再进行 HPLC分析;对固态红曲样品，先用乙腈 萃取，萃取液加等体积水、酸化，再用氯仿 萃取，最后溶于甲醇，进行HPLC分析 荷兰科学家Monica等用等体积的氯仿和甲醇 萃取红曲样品，萃取液经真空浓缩至干、溶解 于流动相，进行HPLC分析 在日本国标法中，红曲色素产品桔霉素检 测，预处理的方法是先用柱色谱分离色素。 即称取一定量的红曲色素，放入分离柱 中，用甲醇:水(体积比7:3)作洗脱剂，收 集一定时间内的流出液(内含桔霉素)，用 HPLC荧光检测.
高效液相色谱法 红曲样品的预处理 高效液相色谱分析 色谱柱 流动相 PH
比较了ZORBAXEclipse XDB-C18( 5μm ,2 50X4.6mm) ,ZORBAXS BC 18( 5μm ,2 50X4.6mm),NUCLEOSIL RP18 (5μm, 250X4.6mm)这三根C18柱对桔霉素定性定量检测的影响。 色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18分离效果图 色谱柱ZCIRBAX SB C18分离效果图
流动相 乙腈和水不同比例混合，实际上决定了混合流动相极性的强弱。这对于分离不同极性的样品是非常重要的。乙腈和水的比例分别选用了:65: 35, 60:40, 55 :45, 50: 50, 45: 55和35:65(v/v)
流动相pH • 根据大多数文献资料，流动相的pH都设定在2.5。这主要是因为，当桔霉素溶液的pH为2.5时，桔霉素呈非离子状态，在荧光检测器检测时信号最强.
在不同的流动相配比条件下桔霉素与其它杂质的分离效果比较在不同的流动相配比条件下桔霉素与其它杂质的分离效果比较
柱温 : 2 8℃ 桔霉素热稳定性差 流速 :1 ml/min或0.8ml/min
在上 述 优 化的高效液相色谱条件下，用标准桔霉素作最低检测限试验，发现:当其质量浓度为0.05mg/l时,仍能检测到,并基线平稳。色谱图如下 标准桔霉素最低检测限 运用 此法检测红曲桔霉素的最低检测限0.05mg/l。此最低检测限低于日本国标法(检测低限为0.2mg/l);而与酶免疫法(检测低限为0.015mg/l)相比，己经非常接近了。
桔霉素抗体的制备 以活性酯法需在碱性条件下进行，一般在0.13mol/L的NaHCO3（PH=9.5）溶液中进行反应可满足要求 桔霉素与载体蛋白结结合 牛血清蛋白、卵清白蛋白等载体蛋白 抗体的产生 抗体的ELISA效价 间接ELISA测小鼠抗血清效价 以自制的桔霉素-OV连接物为免疫抗原，采用腹腔注射的免疫方法免疫小白鼠
N，N’-二环已基碳酰亚胺 桔霉素 N-羟基琥珀酰亚胺 无水四氢呋喃
四 氢 呋 喃 0.2ml 二甲基甲酰胺 BSA/OV 蛋白质溶液 透析
BSA /OV 取少量连接物（ 0.1ml）溶于蒸馏水（ 2.9ml）中，280nm测吸光值，求其中蛋白质含量，根据BSA或OV的分子量，算出其摩尔数；同时取等量连接物溶于甲醇溶液中，320nm测吸光值，求出其中桔霉素的摩尔数，计算两者的摩尔数之比。 桔霉素
桔霉素 BSA /OV 卡介苗
PBST（ 吐温200.05%,PH7.2,0.1mol/l磷酸缓冲溶液、生理盐水) 每孔100μg的包被 抗原(桔霉素-BSA溶于0.1mol/L,PH9.5的碳酸盐缓冲溶液中，浓度为10μg/L) 抗原包被
封 阻 每孔200μL,5%脱脂奶（ 溶于PBST），37℃保温保湿2h，待其恢复至室温，倾去封阻液， PBST满孔洗涤3次，每次5min，扣干。
抗原抗体反应 • 每孔加入100μL以PBST倍比稀释的抗血清和阴性血清，同时设置空白对照（ 以PBST代替血清），37℃保温保湿2h，PBST洗涤扣干5次。
酶标二抗与抗体抗原复合物反应 • 每孔100μL的羊抗鼠IgG:HRP酶标二抗（ 以PBST作1:1000稀释），37℃保温保湿1h， PBST洗涤扣干5次。
底物显色反应 • 每孔加反应底物100μL （ 40mg邻苯二胺溶于100ml，pH5.0，0.1mol/l柠檬酸-0.2mol/l磷酸氢二钠缓冲溶液，再加入150μLH2O（ 现配现用），37℃避光反应30min，每孔50μL，2mol/l硫酸终止反应，5min后以空白对照孔调零，490nm测吸光值。 • 以抗血清的吸光值2倍于阴性血清的吸光值时，抗血清的最大稀释倍数作为抗血清的效价。
抗体的灵敏度 抗原的包被、封阻、酶标二抗反应以及底物显色反应均同以上，不同之处是仅需将抗原抗体反应改为：每孔加入以PBST稀释的1号抗血清90μL（ 稀释度为1：50），同时分别加入不同稀释倍数的桔霉素甲醇溶液10μL，使 桔霉素的反应浓度分别为0、0.036ng/ml、0.36ng/ml、 3.6ng/ml、36ng/ml、360ng/ml、3600ng/ml、36000ng/ml，混匀；同时以10μL PBST代替腹水和桔霉素溶液作空白对照， 37℃保温保湿2h， PBST洗涤扣干3次。桔霉素各浓度的竞争抑制率=（ 各浓度孔的吸光值/阳性对照孔的吸光值）×100。阳性对照孔的吸光值即桔霉素的浓度为0时的吸光值。 以桔霉素的浓度对数为横坐标，以各浓度孔的竞争抑制率为纵坐标，作图得曲线即为竞争抑制曲线，当抑制率达到50%,时所对应的桔霉素浓度为灵敏度。
封 阻 每孔200μL,5%脱脂奶（ 溶于PBST），37℃保温保湿2h，待其恢复至室温，倾去封阻液， PBST满孔洗涤3次，每次5min，扣干。
