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Lez 11. Regolazione post-trascrizionale Alternative splicing Regolazione di RNA terminazione RNA editing Trasposto nucleare localizzazione mRNA Fosforilazione di Initiation factors IRES Stabilità di mRNA Nonsense-mediated mRNA decay IRE/IRPs RNA silencing.
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Lez 11 Regolazione post-trascrizionale Alternative splicing Regolazione di RNA terminazione RNA editing Trasposto nucleare localizzazione mRNA Fosforilazione di Initiation factors IRES Stabilità di mRNA Nonsense-mediated mRNA decay IRE/IRPs RNA silencing
Quattro tipi di splicing alternativi Modelli per due splicing alternativi
Esempio di splicing alternativi del trascritto DSCAM di drosofila
Determinazione del sesso in drosofila È determinato dal rapporto cromosoma X/autosoma (0.5 nei maschi, 1 nelle femmine) La cascata di regolatori determina il sesso Sxl: sex lethal Tra: transformer Dsx: doublesex
Sex in Drosophila by alternative splicing Male Sxl e tra non sono funzionali. Dsx ha splice alternativo Female: sxl si autoregola a regola tra. Tra e tra2 regolano dsx.
Terminazione del RNA: Regolazione Ig • La forma lunga, di membrana, non legge un terminatore debole. Quella corta, secretoria legge lo stop. Aumento di CStF (cleavage stimulation factor F)
Editing di RNA nei mammiferi da A a I • ADAR: Adenosine Deaminase Acting on RNA • Inosina si appaia a C. • In un canale del calcio la mutazione determina GlnArg.
HIV genoma e regolazione dell’export nucleare Genoma di HIV integrato. RRE: Rev Responsive . Element Nella fase tardiva Rev si accumula e trasporta Unspliced RNA nel citosol
Meccanismi di localizzazione del mRNA • Gli mRNA possono essere diretti in zone cellulari prima della traduzione • Il segnale è su 3’ untranslated region (3’UTR)
3’UTR nella compartimentalizzazione del RNA • mRNA di Hairy protein (drosofila) con 3’UTR (rosso) senza 3’UTR (verde) iniettati nell’embrione polinucleato (nuclei blue).
Fosforilazione di initiation factor • eIF-2 è attivo se legato a GTP. eIF-2B cede GTP a eIF-2. • eIF-2 fosforilato lega avidamente eIF-2B e lo sequestra La fosforilazione Diminuisce la sintesi delle proteine
Internal Ribosome Entry Site (IRES) • Sistema alternativo per la iniziazione della traduzione senza capping • IRES prendono strutture che legano alcuni fattori di iniziazione
Meccanismi di degradazione di mRNA • La espressione genica può essere controllata dalla stabilità di mRNA (min a ore) • Accorciamento della coda polyA • Attività di endonucleasi
Competizione tra traduzione e degradazione di mRNA • Il meccanismo di polyA shortening compete direttamente con la traduzione • Nella 3’UTR ci sono sequenze che modificano la velocità di accorciamento
Nonsense-mediated mRNA decay • Meccanismo di controllo del mRNA • Se un codone di terminazione è prima della giunzione esone-introne, il mRNA è riconosciuto e degradato
IRON RESPONSIVE ELEMENT (IRE) Le sequenze di RNA degli Iron Responsive elements (IRE) formano tipiche strutture a stem-loop. Esse si trovano nei 5’ e nei 3’ non tradotti di mRNA che codificano per proteine del metabolismo del ferro, es. ferritine transferrin receptor
Fe/S cluster Domain 4 IRPs: I sensori intracellulari del ferro IRE Animation1, animation2
mRNA Structure • Coding region • Untranslated regions • 5’ UTR • 7methyl-G cap • Bound by cap binding proteins • Translation regulation • 3’ UTR • Stability elements • Subcellular localization (zip codes) • poly(A) tail
Timeline for RNAi Discoveries Nature Biotechnology21, 1441 - 1446 (2003)
miRNA Details • Originate from capped & polyadenylated full length precursors (pri-miRNA) • Hairpin precursor ~70 nt (pre-miRNA) • Mature miRNA ~22 nt (miRNA) • First discovered in 1993 by Victor Ambros at Harvard (lin-4) • Let-7 discovered in 2000 by Frank Slack as a postdoc at Harvard (Ruvkun lab)
Another View Microprocessor Complex
Summary of Players • Drosha and Pasha are part of the “Microprocessor” protein complex (~600-650kDa) • Drosha and Dicer are RNase III enzymes • Pasha is a dsRNA binding protein • Exportin 5 is a member of the karyopherin nucleocytoplasmic transport factors that requires Ran and GTP • Argonautes are RNase H enzymes
What are the functions of miRNA? • Involved in the post-transcriptional regulation of gene expression • Important in development • Metabolic regulation (miR-375 & insulin secretion) • Multiple genomic loci (different expression patterns?)
miRNA Registry • Latest release contains 2909 predicted and verified miRNAs • 321 predicted and 223 experimentally verified in Homo sapiens • Mouse and human are highly conserved • Human is not conserved with plants
siRNA • Cellular response to foreign RNA • New tool for researchers • Can knock down gene expression • Transient or stable expression • Several different methods of expression • Several different methods of delivery
siRNA Design • Initial use of longer dsRNA lead to a non-specific Type I interferon response (widespread changes in protein expressionapoptosis) • Dr. Thomas Tuschl’s lab discovered that RNAi is mediated by 21 and 22 nt RNAs • Also discovered the important characteristics needed by the RNAs
siRNA Expression • For transient expression: duplex RNA can be delivered to the cell • For a stable expression: a vector containing the DNA to produce a hairpin RNA • The vector may be plasmid, retrovirus, adenovirus
siRNA Delivery • For cell culture • Lipid-based transfection • Electroporation • In vivo • Lipid-based • Conjugations • Bacterial phage RNA • Cholesterol • Atelocollagen • Viral systems (ie retrovirus & adenovirus)
Applications for siRNA • Basic research • Determining protein function • Easier than a knockout and may be used for partial knockdowns • Clinical research • You name it • Cancer, hypercholesterolemia, infections, developmental defects
RNA interference (RNAi) Iniziato da double strand RNA (dsRNA) RISC: RNA induced silencing complex