Lez 11

1. Lez 11 Regolazione post-trascrizionale Alternative splicing Regolazione di RNA terminazione RNA editing Trasposto nucleare localizzazione mRNA Fosforilazione di Initiation factors IRES Stabilità di mRNA Nonsense-mediated mRNA decay IRE/IRPs RNA silencing

2. Quattro tipi di splicing alternativi Modelli per due splicing alternativi

3. Esempio di splicing alternativi del trascritto DSCAM di drosofila

4. Controllo positivo e negativo di alternative splicing

5. Determinazione del sesso in drosofila È determinato dal rapporto cromosoma X/autosoma (0.5 nei maschi, 1 nelle femmine) La cascata di regolatori determina il sesso Sxl: sex lethal Tra: transformer Dsx: doublesex

6. Sex in Drosophila by alternative splicing Male Sxl e tra non sono funzionali. Dsx ha splice alternativo Female: sxl si autoregola a regola tra. Tra e tra2 regolano dsx.

7. Terminazione del RNA: Regolazione Ig • La forma lunga, di membrana, non legge un terminatore debole. Quella corta, secretoria legge lo stop. Aumento di CStF (cleavage stimulation factor F)

8. Editing nei mitocondri di tripanosoma

9. Editing di RNA nei mammiferi da A a I • ADAR: Adenosine Deaminase Acting on RNA • Inosina si appaia a C. • In un canale del calcio la mutazione determina GlnArg.

10. HIV genoma e regolazione dell’export nucleare Genoma di HIV integrato. RRE: Rev Responsive . Element Nella fase tardiva Rev si accumula e trasporta Unspliced RNA nel citosol

11. Meccanismi di localizzazione del mRNA • Gli mRNA possono essere diretti in zone cellulari prima della traduzione • Il segnale è su 3’ untranslated region (3’UTR)

12. 3’UTR nella compartimentalizzazione del RNA • mRNA di Hairy protein (drosofila) con 3’UTR (rosso) senza 3’UTR (verde) iniettati nell’embrione polinucleato (nuclei blue).

13. Fosforilazione di initiation factor • eIF-2 è attivo se legato a GTP. eIF-2B cede GTP a eIF-2. • eIF-2 fosforilato lega avidamente eIF-2B e lo sequestra La fosforilazione Diminuisce la sintesi delle proteine

14. iniziazione negli eucarioti

15. Internal Ribosome Entry Site (IRES) • Sistema alternativo per la iniziazione della traduzione senza capping • IRES prendono strutture che legano alcuni fattori di iniziazione

16. Meccanismi di degradazione di mRNA • La espressione genica può essere controllata dalla stabilità di mRNA (min a ore) • Accorciamento della coda polyA • Attività di endonucleasi

17. Competizione tra traduzione e degradazione di mRNA • Il meccanismo di polyA shortening compete direttamente con la traduzione • Nella 3’UTR ci sono sequenze che modificano la velocità di accorciamento

18. Nonsense-mediated mRNA decay • Meccanismo di controllo del mRNA • Se un codone di terminazione è prima della giunzione esone-introne, il mRNA è riconosciuto e degradato

19. IRON RESPONSIVE ELEMENT (IRE) Le sequenze di RNA degli Iron Responsive elements (IRE) formano tipiche strutture a stem-loop. Esse si trovano nei 5’ e nei 3’ non tradotti di mRNA che codificano per proteine del metabolismo del ferro, es. ferritine transferrin receptor

20. Fe/S cluster Domain 4 IRPs: I sensori intracellulari del ferro IRE Animation1, animation2

21. Regolazione coordinata di proteine

22. mRNA Structure • Coding region • Untranslated regions • 5’ UTR • 7methyl-G cap • Bound by cap binding proteins • Translation regulation • 3’ UTR • Stability elements • Subcellular localization (zip codes) • poly(A) tail

23. mRNA

24. Timeline for RNAi Discoveries Nature Biotechnology21, 1441 - 1446 (2003)

25. miRNA Details • Originate from capped & polyadenylated full length precursors (pri-miRNA) • Hairpin precursor ~70 nt (pre-miRNA) • Mature miRNA ~22 nt (miRNA) • First discovered in 1993 by Victor Ambros at Harvard (lin-4) • Let-7 discovered in 2000 by Frank Slack as a postdoc at Harvard (Ruvkun lab)

26. Illustration of miRNA processing

27. Another View Microprocessor Complex

28. Summary of Players • Drosha and Pasha are part of the “Microprocessor” protein complex (~600-650kDa) • Drosha and Dicer are RNase III enzymes • Pasha is a dsRNA binding protein • Exportin 5 is a member of the karyopherin nucleocytoplasmic transport factors that requires Ran and GTP • Argonautes are RNase H enzymes

29. What are the functions of miRNA? • Involved in the post-transcriptional regulation of gene expression • Important in development • Metabolic regulation (miR-375 & insulin secretion) • Multiple genomic loci (different expression patterns?)

30. Differences in miRNA Mode of Action

31. miRNA Registry • Latest release contains 2909 predicted and verified miRNAs • 321 predicted and 223 experimentally verified in Homo sapiens • Mouse and human are highly conserved • Human is not conserved with plants

32. siRNA • Cellular response to foreign RNA • New tool for researchers • Can knock down gene expression • Transient or stable expression • Several different methods of expression • Several different methods of delivery

33. siRNA Design • Initial use of longer dsRNA lead to a non-specific Type I interferon response (widespread changes in protein expressionapoptosis) • Dr. Thomas Tuschl’s lab discovered that RNAi is mediated by 21 and 22 nt RNAs • Also discovered the important characteristics needed by the RNAs

34. siRNA Expression • For transient expression: duplex RNA can be delivered to the cell • For a stable expression: a vector containing the DNA to produce a hairpin RNA • The vector may be plasmid, retrovirus, adenovirus

35. siRNA Delivery • For cell culture • Lipid-based transfection • Electroporation • In vivo • Lipid-based • Conjugations • Bacterial phage RNA • Cholesterol • Atelocollagen • Viral systems (ie retrovirus & adenovirus)

36. siRNA Delivery & Processing

37. Applications for siRNA • Basic research • Determining protein function • Easier than a knockout and may be used for partial knockdowns • Clinical research • You name it • Cancer, hypercholesterolemia, infections, developmental defects

38. RNA interference (RNAi) Iniziato da double strand RNA (dsRNA) RISC: RNA induced silencing complex

39. Film da Nature