AFİNİTE KROMATOGRAFİSi

1. AFİNİTE KROMATOGRAFİSi Arş.Gör. Nahit GENÇER

2. Afinite Kromatografisi Afinite Kromatografisinin Temel İlkesi Uygulama Basamakları Matriks Seçimi Spacer ( uzantı kolu) Seçimi Afinite Marikslerinin Sentezi Tekniğin Uygulanışı

3. Afinite kromatografisi bir saflaştırma yöntemidir ve tek bir basamakta yüzlerce kat saflaştırma yapılabilir. Bu teknik bir çeşit adsorbsiyon kromatografisi olup; matriks adı verilen katı bir destek materyaline, ligandın kovalent olarak immobilize edilmesi işlemini kapsar. Afinite kolonundan saflaştırılması istenilen molekül içeren bir karışım geçirilirse sadece istenen molekül ligand tarafından tutulur. İstenmeyen safsızlıklar kolondan uygun bir tamponla ayrılır. Kolonda tutulan ilgili molekül spesifik elüsyonla kolondan alınır.

4. Bir afinite kromatografisi işlemi genel olarak aşağıdaki kurallar altında toplanabilir; 1) Uygun bir ligand seçimi 2) Matriks üzerine ligand immobilizasyonu 3) Protein karışımının kolona yüklenmesi 4) Safsızlıkların uzaklaştırılması 5) İstenilen proteinin saf olarak elüsyonu

5. Matriks seçiminde bazı kriterler 1-Matriks yüksek derecede porozite içermelidir. 2-Matriks aktivasyon, bağlanma, çalışma ve rejenerasyon koşullarında kimyasal olarak stabil olmalıdır. 3-Matriks, iyi bir akışanlık göstermesi ve mekanik karıştırmalarda kırılmaya uğramaması için rijid bir yapıya sahip olmalıdır. 4-Matriks belli bir pH ve sıcaklık aralığına dayanıklı olmalıdır. 5-Matriks kolay aktive edilmelidir.

6. Ticari olarak Satılan Matriksler

7. Spacer Arm Seçimi Saflaştırılması istenen molekülün liganda bağlanması çoğu durumda matriks ile ilgili molekül arasındaki sterik engelden dolayı zorlaşmakta ve kolon verimi düşmektedir. Bu problem uygun uzantı kolu kullanılarak ortadan kaldırılabilir

8. LİGAND SEÇİMİ 1) Bağlanma şiddeti: M+L ML 2) Reversibilite: 3) Stabilite: 4) Büyüklük: 5) Afinite:

9. Saflaştırılacak molekül ve Kullanılan Ligandlar

11. NH NH C CH OH COOH N=N SO2NH2 a b Uzantı kolu L Tirozin c Ligand Karbonik anhidrazın spesifik inhibitörü Sülfonilamid LİGANDIN İMMOBİLİZASYONU İmmobilizasyon proteini suda çözünmeyen bir materyale bağlama işlemidir. İmmobilizasyon elde etmek istediğimiz proteinin saflık yüzdesini arttırır. Matriks (Sepharose-4B)

12. Eritrositlerden Karbonik Anhidraz Enziminin Saflaştırılması İçin Geliştirilmiş Afinite Jelinin Kimyasal Yapısı Ligant ( CA spesifik İnhibitörü) Sulfanilamid Mariks Sepharose 4B Uzantı Kolu L-Tirozin

13. Afinite Matrikslerinin Sentezi Afinite matrikslerinin sentezinde kullanılan yöntemler ligandın kimyasına ve spacer gereksinimine bağlıdır.. Matriks; spacer ve ligandın kovalent olarak bağlanmasını oldukça ılımlı bir şekilde sağlayan yöntemlerle aktive edilmelidir. Aktive edilen matriks bir çok örnekte aminlerle kolaylıkla reaksiyona giren bir elektrofil içerir. CNBr ile aktive matriksler: genellikle agaroz matriksin hidroksil gruplarının reaksiyonlarını içerir.

14. S e p h a r o s e - 4 B I n t e r m e d i a t e I m i d o c a r b o n a t e C y a n a t e s t r u c t u r e ( r e a c t i v e ) L - t y r o s i n e S e p h a r o s e - 4 B - L - t y r o s i n e A f AFİNİTE JELİNİN SENTEZİ O H N O O - C B r C N C N H p H 1 1 O H O O H H H N C C H O H 2 2 C O O H S O N H 2 2 O H + - O H N C l 2 C N H C C H O H O 2 C N H C C H O H O D i a z o t i z e d 2 C O O H S u l f a n a m i d e C O O H p H 9 . 5 N N O H O H f i n i t y G e l S O N H 2 2

15. . Epoksi aktive matriksler: Elektrofil olarak aktif epoksi grubunun kullanıldığı matrikslerdir.

16. Afinite Kromatografisinin Temel İlkesi

20. Non Spesifik Olarak Bağlanmış Proteinlerin Uzaklaştırılması Yıkama tamponları en iyi absorbsiyon ve elüsyon koşulları arasında arada bir yerde olmalıdır.

22. ELÜSYON KOŞULLARININ SEÇİMİ • Ligand protein etkileşimleri çeşitli moleküler etkileşimlerin bir araya gelmesinden kaynaklanır. Bunun için elüsyon koşulları seçiminden spesifik şu özelliklere dikkat etmek gerekir. • İyonik şiddetin seçimi: • pH Değişimi: • Selektif Elüsyon ya da Afinite Elüsyonu