1 / 42

Mikroorganismu gēnu inženierija

Mikroorganismu gēnu inženierija. 1 3 . lekcija. Selektīvie marķieri. + Antibiotiskās vielas. Selektīvie marķieri. Pielietojums: 1. Transformēto baktēriju atlasei, 2. Plazmīdu uzturēšanai šūnās, 3. Rekombinatu vektoru atlasei. Selektīvie marķieri. Viens selektīvais marķieris. Ap R.

goro
Download Presentation

Mikroorganismu gēnu inženierija

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Mikroorganismu gēnu inženierija 13. lekcija Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  2. Selektīvie marķieri + Antibiotiskās vielas Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  3. Selektīvie marķieri Pielietojums: 1. Transformēto baktēriju atlasei, 2. Plazmīdu uzturēšanai šūnās, 3. Rekombinatu vektoru atlasei. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  4. Selektīvie marķieri Viens selektīvais marķieris ApR + Ampicilīns Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  5. Selektīvie marķieri Divi selektīvie marķieri ApR TcR + inserts ApR TcS Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  6. Selektīvie marķieri Divi selektīvie marķieri Rekombinanti + Ampicilīns + Tetraciklīns+ Ampicilīns Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  7. Selektīvie marķieri Divi selektīvie marķieri Rekombinantās kolonijas + Ampicilīns + Tetraciklīns+ Ampicilīns Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  8. Ampicilīns(Ap) - pussintētiska b-laktāmu (penicilīnu) grupas antibiotiska viela ar plašu iedarbības spektru (Gram "+" un "-") , ieviesta 1961. gadā. Nogalina tikai augošas baktērijas, kavējot baktēriju šūnapvalka veidošanu (inhibē šūnapvalka sastāvā ietilpstošo peptidoglikānu sintēzi). Penicilīnu vispārīgā formula Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  9. Ampicilīns(Ap) Rezistenci pret Ap nodrošina enzīmi, penicilināzes jeb b-laktamāzes, kas šķeļ b-laktāma gredzenu, veidojot penicilīnskābi. Penicilināzes jeb b-laktamāzes ir periplazmatiski enzīmi, kuri spēj uzkrāties šūnu augšanas vidē, salīdzinoši ātri noārdot barotnei pievienoto antibiotisko vielu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  10. Selektīvie marķieri Lielākā daļa plazmīdu vektoru satur Ap rezistences (b-laktamāzes - bla) gēnu no Tn3 (transpozona 3) Barotnēs ampicilīnu lieto koncentrācijās 50-100 µg/ml. Termonestabils (vārot vai autoklavējot sāk sadalīties). Ūdenī labi šķīst vienvērtīgo katjonu (natrija) sāļi, šķīdumu sterilizē ar ultrafiltrāciju. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  11. Tetraciklīni(Tc) - plaša iedarbības spektra antibiotikas, kuras atklātas 50 -tajos gados. Var iegūt ķīmiskās sintēzes ceļā vai izdalīt no aktinobaktērijām (Streptomyces ģints). Tetraciklīniem piemīt bakteriostatisks efekts - tie kavē proteīnu biosintēzi saistoties ar prokariotu ribosomas 30S subvienību un neļaujot aminoacil-tRNS pareizi iekļūt ribosomas A centrā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  12. Selektīvie marķieri Rezistenci pret Tc nodrošina efflux proteīns, kas izmaina baktēriju šūnas membrānu struktūru un kavē tetraciklīna nonākšanu šūnā, nodrošina tā samazinātu koncentrācijubaktērtiju citoplazmā. Plazmīdu vektoros biežāk izmantotais irtetA gēns, kurš iegūts no plazmīdas pSC101. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  13. Selektīvie marķieri Barotnēs tetraciklīnu lieto koncentrācijās 12-15 µg/ml. Termonestabils, gaismā sadalās Lieto tetraciklīna hidrohlorīdu, šķīdinot 50% etanolā, serilizē ar ultrafiltrāciju. Tetraciklīna darbības efektivitāti samazina Mg2+ klātbūtne. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  14. Hloramfenikols - (arī hloromicetīns, levomicetīns). Plašas iedarbības spektra antibiotika, kuru atklāja 1947. gadā aktinobaktērijās. Pašlaik iegūst tikai sintētiski. Hloramfenikolam piemīt bakteriostatisks efekts - tas saistās pie baktēriju ribosomas 50S subvienības un inhibē peptidil-transferāzes aktivitāti - peptīdsaites veidošanu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  15. Selektīvie marķieri Hloramfenikola rezistenci nosaka enzīms: hloramfenikol-acetiltransferāze (cat), kas katalizē acetil grupu pārnešanu no Acetil-CoAuz antibiotiku, tādējādi to inaktivējot. Barotnēs hloramfenikolu lieto koncentrācijā 10 µg/ml. Plazmīdu amplifikācijai- 170 µg/ml. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  16. Selektīvie marķieri Hloramfenikols. Samērā stabils. Šķīdina 96-100% etanolā vai metanolā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  17. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  18. GIvektori Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  19. Plazmīdu vektori Plazmīdu vektoru trešā paaudze: • mākslīgi konstruētas plazmīdas, kas nodrošina efektīvu, plašu variāciju DNS klonēšanu un klonu atlasi, - liels kopiju skaits, (pUC19), - specializēti ekspresijas vektori, - shuttle vektori. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  20. pUC grupas plazmīdu vektori Izveido Messing un Vieira 80-tajos gados. Plazmīdas ir veidotas uz pBR322 bāzes - satur to pašu replikācijas ORI un Ap rezistences gēnu. Papildus - MCS (Multiple Cloning Site) rajons, kurā atrodas vairāki unikāli restriktāžu saiti. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  21. pUC grupas plazmīdu vektori Nesatur rop gēnu. rop rajona delēcija nodrošina plazmīdas palielinātu kopiju skaitu. Līdz ar to šīm plazmīdām amplifikācija ar hloramfenikolu nav tik efektīva. Papildus satur lacoperona elementus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  22. lac operons • lac operona elementi tiek lietoti: • gēnu regulācijas pētījumos, • ekspresijas vektoros • parastos vektoros marķiersistēmu veidošanai Dabā lac operona gēnu produkti baktērijām dod iespēju ātri pārslēgties uz laktozes izmantošanu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  23. t t Pi P/Olac lac operons Dabīgais, E. coli genomā esošais (wt). Gēni: lacI represors lacZ ß-galak- tozidāze lacY per- miāze lacA trans- acetilāze Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  24. lac operons Lacoperona represora gēns. Pi - promoters laktozes operona represoru gēnam, ekspresija konstitutīva, vāja, uztur ap 40 mRNS molekulas šūnā. RNApol. t Pi lacI Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  25. RNApol. t Pi lacI lac operons 38 kDa represora proteīni veido tetramērus Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  26. RNApol. t P/Olac Gēni: lacZ lac operons Kuri saistalac operona operatoru un RNS polimerāze pie P/Olac nevar darboties. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  27. RNApol. lac operons Ja vidē parādās laktoze, tā kā induktors saistās ar represoru un komplekss pamet operatoru. t P/Olac Gēni: lacZ Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  28. RNApol. lac operons Notiek operona transkripcija. t P/Olac Gēni: lacZ Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  29. lac operons Vektorus un to rekombinantus, kuros ietverti lacZ operona regulācijas elementi, nav vēlams ievietot E. coli celmos ar darbīgu šo operonu. Šim nolūkam izveidotaslac- līnijas, kurās dabīgais lacZoperons ir defektīvs. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  30. pUC grupas plazmīdu vektori lacoperona elementi vektoros: - lacZ gēna fragments (kodē b-galaktozidāzes N-gala 146 aminoskābes, sauc arī par -peptīdu) - lacpromoters. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  31. pUC grupas plazmīdu vektori Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  32. pUC grupas plazmīdu vektori pUC grupas plazmīdas atļauj tieši fenotipiski detektēt insertu saturošās kolonijas (zili / baltā selekcija). Cietajai barotnei papildus jāpievieno: - IPTG, - X-Gal. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  33. IPTG Izopropil-b-D-1-tiogalaktopiranozīds (IPTG) lac represoru (LacI) sintētisks induktors - uz lac represoriem iedarbojas līdzīgi laktozei. Tā pievienošana barotnei nodrošina: - lac promotera indukciju un - b-galaktozidāzes a polipeptīda sintēzi. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  34. IPTG b-galaktozidāzes a polipeptīds papildina defektīvo hromosomālo vai episomālo b-galaktozidāzi (lacZDM15) un veidojas aktīvs enzīms - ß-galaktozidāze. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  35. X-Gal 5-brom-4-hlor-3-indolil-b-D-galaktopiranozīds (X-Gal). Sintētisks, hromogēns, b-galaktozidāzes substrāts. Ja tiek hidrolizēta glikozīdiskā saite, atdalītais heterocikls kļūst par gaišzilu pigmentu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  36. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  37. pUC grupas plazmīdu vektori MCS (pUC19) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  38. pUC grupas plazmīdu vektori pUC grupas plazmīdu pielietojums: • DNS klonēšanai un subklonēšanai iespējama insertu ligēšana noteiktā virzienā, ērta rekombinantu atlase; • klonētās DNS sekvenēšanai • (universālie tiešais un reversais praimeris); Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  39. pUC grupas plazmīdu vektori pUC grupas plazmīdu pielietojums: • klonētās DNS ekspresijai, izmantojot - lacZ promoteru un - lacZ translācijas iniciācijas signālus vai izmantojot klonētā gēna regulātoros elementus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  40. pUC grupas plazmīdu vektori pUC grupas plazmīdu trūkumi: • ļoti liels un neregulējams kopiju skaits; • tikai viens selektīvais marķieris; • lacZ promoters nav piemērots universālai un precīzai proteīnu ekspresijai. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  41. pUC grupas plazmīdu vektori pUC grupas plazmīdu trūkumi: Kopumā vērtējot, pUC grupas plazmīdas ir ērti DNS subklonēšanas vektori, bet tie ne vienmēr atbilst dažādām specifiskām prasībām. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  42. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

More Related