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彭道荣 第四军医大学西京医院全军临床检验医学中心

HBV 血清学标志物的检测面临的挑战. 彭道荣 第四军医大学西京医院全军临床检验医学中心. HBsAg Prevalence. > 8% - High. 2-7% - Intermediate. <2% - Low. 乙型肝炎的全球发病情况. Geographic Distribution of Chronic HBV Infection. 全球约有 20 亿人曾感染过乙肝 其中 3.5 亿人为慢性 HBV 感染者 约 1.3 亿在中国 每年约有 35 万人死于慢性乙肝相关疾病.

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  1. HBV血清学标志物的检测面临的挑战 彭道荣 第四军医大学西京医院全军临床检验医学中心

  2. HBsAg Prevalence >8% - High 2-7% - Intermediate <2% - Low 乙型肝炎的全球发病情况 Geographic Distribution of Chronic HBV Infection • 全球约有20亿人曾感染过乙肝 • 其中3.5亿人为慢性HBV感染者 • 约1.3亿在中国每年约有35万人死于慢性乙肝相关疾病 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en

  3. 中国乙型肝炎的流行情况 2009年卫生部统计资料显示： 乙型肝炎现患率：277/万 年发病率：95/万 流行病学调查表明： 我国约有1.3亿人为乙肝病毒携带者（占全球感染人数的1/3），其中慢性乙肝患者约3000万例，乙肝表面抗原的携带率高达10.34%。

  4. 本地区HBV 流行情况 西京医院检验科免疫室2010年5、6、7月住院及门诊患者 HBV、HCV、TP及HIV检出率

  5. HBV感染标志物检测面临的挑战 • 检测方法学（检测仪器、试剂） • 病毒变异问题（ＨＢＶ） • 正确诠释各类模式（ＨＢＶ） • 与临床的沟通

  6. 检测方法学（检测仪器、试剂） 肝炎病毒实验室诊断常用方法 • 酶联免疫吸附实验（ELISA） • 快速检测技术：印迹（滲滤、层析、胶体金标） • 发光检测技术：荧光免疫、化学、电化学发光等 • 核酸定量检测：DNA、RNA定量 • 补充/确认实验：重组免疫印迹 (RIBA)

  7. 检测方法学必须关注的几个问题 敏感性：假阴性的排除能力 分析灵敏度 临床灵敏度 特异性：假阳性的排除能力（尤其是在低流行区域） 对不同血清型、基因型、突变株的检出能力 高精密度：批内及批间 试剂批间稳定性 检测系统的性能可靠性，自动化，随机进样，溯源性 实验室内可执行性，工作流程

  8. 中国HBsAg感染的低水平状态 • 浙江大学第一附属医院在2002年调查： • 8089例病人中, 2.34%< 5 ng/ml • 816表面抗原阳性的人群中 23.16% <5 ng/ml • 其中84例 < 1 ng/ml (44.4%) • 33例 <2, >1 ng/ml (17.5%) • 72例 <5, >2 ng/ml (38.10%)

  9. HBsAg试剂能够满足临床的需要么？ • 2006年临床化学杂志 －－美国华盛顿大学 • 1. 以前在HBV DNA检测方法不是很灵敏度的时候认为HBsAg 阳性而DNA阴性代表病毒的静默期，没有复制； • 2. 随着更灵敏的DNA检测方法的使用，人们也发现HBsAg阴性而DNA阳性的状况； • 第一个原因是处于窗口期 • 由于HBsAg检测的灵敏度决定的 • 3. 突变的检测能力。

  10. 17种在欧洲上市HBsAg试剂分析灵敏度 2006年

  11. 17种在欧洲上市的HBsAg分析灵敏度表现 灵敏度表现最好的试剂和最差的试剂之间相差10倍 Scheiblauer H, Soboll H, Nick S. Evaluation of 17 CE-marked HBsAg assayswith respect to clinical sensitivity, analytical sensitivity, and hepatitis B virus mutant detection. J Med Virol 78(Suppl 1):S66–S70, 2006.

  12. 国内外HBsAg诊断试剂灵敏度评估国家参考品adr血清的检测结果国内外HBsAg诊断试剂灵敏度评估国家参考品adr血清的检测结果

  13. HBV感染标志物检测面临的挑战 • 检测的方法学评价（检测仪器、试剂） • 病毒变异问题（ＨＢＶ） • 正确诠释各类模式（ＨＢＶ） • 与临床的沟通

  14. HBsAg 变异及常见的突变位点 HBsAg 变异 a保守区域最常见的突变位点是： • G145R，K141E，T131I的更换 • 122 and 123 之间的插入 另外，所有在a区域附近的突变也会影 响其抗原结构，以至影响整个反应特性 抗原决定簇结构发生了替换、缺失或是插入等变化 *Weber B. Expert Rev Mol Diagn 2005, 5: 75-91.

  15. 什么情况下会发生HBsAg变异? • HBsAg突变的文献始于1990年 • 突变在全球范围内有报道 慢性肝炎患者在长期治疗的情况下：拉米夫定治疗2年有1/4或者更多的人会产生基因突变。 HBsAg阳性的母亲, 新生儿疫苗接种失败 证明 肝移植病人, 免疫预防剂使用失败 Reference: Carman, W. F. et al. 1990. Vaccine-induced Escape Mutant of Hepatitis B Virus. Lancet 336: 325 - 329. Hunt, C. M. et al. 2000, Clinical Relevance of Hepatitis B Viral Mutations. Hepatology 31: 1037 - 1034. Oon, C.J. et al. 1995 Molecular epidemiology of hepatitis B virus vaccine variants in Singapore. Vaccine 13: 699-702. Locarnini, S. A. 1998. Hepatitis B Virus Surface Antigen and Polymerase Gene Variants: PotentialVirological and Clinical Significance. Hepatology 27: 294 - 297.

  16. 台湾的变异率研究 the prevalence of hepatitis B surface gene a determinant mutants increased from 7.8% before the launch of the vaccination program， to 19.6% at 5 years after，28.1% at 10 years after 疫苗接种前 HBV阳性儿童中变异率为 7.8% 5年后为19.6% 10年后为28.1%

  17. 为什么HBsAg变异重要? 影响乙肝防疫(疫苗) 流行(血站、医院筛查) 影响乙肝的诊断 HBsAg变异 不必要的复杂性 延误诊断及治疗 HBsAg变异 假阴性结果

  18. 漏检HBsAg变异株后果 90%感染HBV 的新生儿将成为慢性携带者。 根据美国CDC的统计此人群中的死亡率为15~25% (见CDC website http://www.cdc.gov) 美国 CDC 估计美国有 22,000 HBV阳性的母亲将产子。有变异情况的约 1.0 ~ 4.6%。所以在美国此人群中, 每年有220 ~ 1012 人发生变异。

  19. 评估13种常见变异株，ELISA只能检测其中的3种 数据来源: Med Microbiol Immunol June,2006

  20. HBsAg的突变如何影响检测诊断? 目前的单克隆HBsAg检测试剂 • 改变蛋白/抗原位点的结构 • 单克隆抗体不能识别/结合抗原位点 • 分析试剂不能检测到样品中的HBsAg • 造成假阴性的结果 • 选择的检测抗原位点在aa 100-160区域内 抗原位点变异 一些商品化试剂 References: Oon, C.J. et al. 1995. Molecular epidemiology of Hepatitis B virus vaccine variants in Singapore. Vaccine 13: 699-702. Coleman, P.F. et al. 1999. Immunoassay Detection of Hepatitis B Surface Antigen Mutants. Journal of Medical Virology 59: 19-24. Hunt, C.M. et al. 2000. Clinical Relevance of Hepatitis B Viral Mutations. Hepatology 31: 1037-1044.

  21. 如何实现对变异株的检测 两种单克隆捕捉抗体/一种多克隆信号抗体；寡聚的单克隆信号抗体

  22. 完善对变异株的检测 ------ 特异性的提高 • 在HBsAg 低水平流行区域，特异性降低0.1%，就会对PPV带来很大的影响。 • 为了使更少的标本落入灰区，阴性和阳性标本的区分能力应该高些。 • 额外的确认实验 • 随访

  23. 使用中和试剂来确认弱阳性标本 • 高水平的检测试剂应该是灵敏度和特异性结合的结果

  24. HBV感染性标志物检测面临的挑战 • 检测的方法学（检测仪器、试剂） • 病毒变异问题 • 正确诠释各类模式 • 与临床的沟通

  25. 乙型肝炎病毒 丹氏颗粒和基因组 HBV HBsAg HBcAg DNA 多聚酶 双链DNA HBeAg • 不完全的双链循环DNA病毒 • 属于肝脱氧核糖核酸病毒科 研究Dane颗粒基因组结构发现，DNA分子含有约3200个核苷酸

  26. 乙型肝炎病毒颗粒 感染性的完整颗粒 呈球形，具有双层 衣壳，直径为42nm 小球形颗粒，为不完整颗粒，不能复制。 成分：HBsAg，一般很少含Pre S1或Pre S2抗原。 直径为22nm 管形颗粒成分与小球形相同 直径22nm，长100～500nm

  27. 有传染性 传染性不明 有免疫力 可能有传染性 急性乙肝病毒感染发展到最后HBsAg可以转阴（病毒被清除）

  28. Symptoms ant-HBe HBeAg ant-HBc IgG HBsAg ant-HBc IgM ant-HBs 4 12 16 36 52 8 28 100w 0 20 24 32 乙肝表面抗原(HBsAg) • 第一个出现的血清指标 • 持续或>6月为慢性感染 • 高浓度表示高复制，>100ug/ml常同时伴HBeAg(+)具有传染性 • 低浓度的HBsAg可能是: • 在感染的恢复期，病毒低复制或不复制 • 可能是病毒变异 HBsAg(-)仍有可能有HBV感染，

  29. HBsAg的假阴性 • 假阴性可见于以下情况： • 窗口期：HBsAg合成初期或疾病恢复、病毒血症下降期， • HBsAg含量较低，未达到检测下限； • 低水平携带者 ：慢性HBV感染者，HBsAg在许多年后逐渐被 • 清除，其含量不足检测下限； • S基因突变或变异者 • 其他干扰因素 目前欧洲市场上准入试剂检测下限已经达到0.15ng/ml

  30. 乙肝表面体（HBsAb） HBsAb HBsAg 保护性抗体 (>10Iu/ml) 乙肝病毒 NO! 肝细胞 感染过HBV、康复和获免疫力的标志（中和抗体）

  31. 乙肝表面体（HBsAb） 感染过HBV、康复和获免疫力的标志（中和抗体） • 失去 HBsAg后的恢复指标，提示急性感染后的康复 • 发病后转阳或效价显著升高，亦具有诊断价值 • 如伴有高效价抗-HBs者，不能排除有持续性HBV感染的可能。 • HBsAb与HBsAg同时阳性可见于暴发性肝炎或慢性活动性肝炎 • 疫苗注射后的免疫性评价指标，可维持数年至10余年

  32. HBsAb与预防接种 德国STIKO疫苗评价推荐 无应答者: 无抗体产生 -- 复种并随访Anti-HBs 低应答者: <10mIU/ml --复种并随访Anti-HBs 中应答者: 10~100mIU/ml – 每3~6个月Anti-HBs评估 高应答者: >100mIU/ml – 10年后复种

  33. HBsAb与乙肝的预防接种 国内疫苗评价标准 Anti－HBS(mIU/ml)接种要求 <10 立即 11 ～100 3-6月后 101 ～1000 1年后 1001 ～10000 3.5年后 >10000 7年后 无应答者: 无抗体产生-- 加强计量复种 低应答者: <10mIU/ml -- 加强计量复种 中应答者: 10~100mIU/ml 无须复种 高应答者: >100mIU/ml 无须复种

  34. 乙肝e抗原 (HBeAg) Symptoms ant-HBe ant-HBc IgG HBsAg ant-HBc IgM ant-HBs 4 12 16 36 52 8 28 100w 0 20 24 32 存在于急性、慢性感染中 • HBeAg是急性活动期感染的早期指标，存在时间段3～6周 • HBeAg持续>10 周，预示转为慢性携带者或可能为慢性肝病 • 与病毒复制相关，常与HBV-DVA水平一致，具有高度传染性 • HBeAg缺乏， 不代表病毒复制不存在 HBeAg

  35. 乙肝e抗原（HBeAg） 基线值转换几率 Symptoms ant-HBe ant-HBc IgG HBsAg ant-HBc IgM ant-HBs 4 12 16 36 52 8 28 100w 0 20 24 32 在治疗后72周时的血清转换率与HBeAg的基线值呈独立相关 1. HBeAg <10 PEIU/ml，72周 时有55％的转阴率 2. HBeAg >100PEIU/ml，72周 时，只有<5%的转阴率 HBeAg 3. 在治疗中HBV DNA的下降与 HBeAg血清转换不一定一致 治疗后24周的HBeAg 水平与是否产生药物应答有相关

  36. 乙肝e抗原 (HBeAg) 应用 1. HBeAg阳性： 患有乙型肝炎，是病毒复制活跃，传染性强的指标，且HBeAg持续阳性的乙型肝炎，易转变为慢性肝炎, 肝硬化。 2. HBeAg(+)、HBsAg (+) 孕妇所生的新生儿，母婴垂直传播的机会达90%，人工喂养儿为：33. 33 %，值得重视。

  37. 乙肝e抗体 (HBeAb) Symptoms ant-HBe HBeAg ant-HBc IgG HBsAg ant-HBc IgM ant-HBs 4 12 16 36 52 8 28 100w 0 20 24 32 1. 当HBeAb与 HBeAg 消失出现, 表示病毒复制渐趋静息。 2. HBe血清转换似为HBV感染 过程的一个转折点，但在慢 性活动性肝病HBeAb(+)未必 表示病毒不复制。 3. 有些HBeAg消失后不出现 HBeAb。

  38. 乙肝e抗体 (HBeAb) 临床应用 抗HBe不是保护性抗体 1. 多见于急性肝炎恢复期的病人血清中 ，意味着 HBV部分被清除或抑制，复制减少，传染性降低，但慢性肝炎，肝硬化几率增高。还可见于慢性肝炎，肝硬化。抗HBe阳性说明病毒复制减少，传染性弱，但并非无传染性。 2.HBeAb和HBeAg一般不同时存在； HBeAg消失，HBeAb产生。HBeAb（+）说明患者曾出现过HBeAg。但对HBeAb（+）者不可视为HBV复制平息。 3.比抗-HBs转阳要早，常在HBsAg消失前后出现 。 4. 可见于无症状的HBsAg携带者

  39. HBeAg阳性的慢肝病人长期缓解标志 ------------- HBeAg血清转换 美国的乙肝治疗指南：eAg转换 确定应答终点包括：ALT正常 HBV-DNA低于检测水平 HBeAg 阴性，伴有或者不伴有eAb 组织学改善。 • 中国的乙肝治疗指南： • 完全应答：eAg转换，HBV-DNA阴性， ALT正常 • 部分应答：HBV-DNA 阴性，ALT正常。 1. Realdi et al. Gastroenterology 1980; 2. Hoofnagle et al. Ann Intern Med 1981; 3. Liaw et al. Gastroenterology 1983; 4. Chu et al Hepatology 1985; 5. Liaw et al Hepatology 1991; 6. Hsu et al. Hepatology 2002; 7. Lok et al. Gastroenterology 1993; 8. Niederau et al. N Eng J Med 1996; 9. Lau et al. Gastroenterology 1997; 10. Krogsgaard. J Viral Hep 1998; 11. Lin eogy 1999

  40. 欧洲肝病学会乙肝防治指南 （EASL 2003 ） • HBV保持复制活性（HBV-DNA≥105 copies/mL） • 转氨酶3 ~ 6月内持续升高，建议进行治疗。 • 对于HBeAg(+)的慢性乙肝患者而言，采用干扰素治 • 疗结束后，应该检测HBeAg、 HBeAb和HBV-DNA • 水平，且每6个月评估病毒学反应。 • 对于HBeAg（-）的慢性乙肝患者而言，在经过抗 • 病毒治疗后，检测血清HBV-DNA水平是评估病毒 • 学反应的唯一方式。 http://www.jhep-elsevier.com/article/PIIS0168827803003787/fulltext#section7

  41. Anti-HBe高灵敏度检测的临床应用价值 临床价值： 在多余HBeAg存在的条件下即能早期发现Anti-Hbe的血清转换， 对于指导医生的治疗有更灵敏的应用价值。 Journal of Medical Virology ; 60;256-63(2000)

  42. Symptoms 抗-HBe HBeAg 抗-HBc IgG HBsAg 抗-HBc IgM 抗-HBs 4 12 16 36 52 8 28 100w 0 20 24 32 HBcAb－IgM • 表示急性感染 • 发病一周出现占90%,也有1个月 • 持续时间2~134周,14%超过1年 • 高滴度是诊断急性乙肝的“金标准” (但需特殊标定) • IgM(+)，即使HBsAg(-)，也可诊断急性肝炎。 • 暴发性乙型肝炎: 可检出4~8倍的IgM浓度。

  43. Symptoms ant-HBe HBeAg ant-HBc IgG HBsAg ant-HBc IgM ant-HBs 4 12 16 36 52 8 28 100w 0 20 24 32 乙肝核心抗体IgG (HBcAb-IgG) • 表示现在或既往感染 • 恢复或免疫无必然联系 • 因HBcAg的高免疫原性，故HBcAb产生比HBsAb早且多，持续时间长(数十年) • 在我国正常人群中有10%的单一HBcAb(+)

  44. Symptoms ant-HBe HBeAg ant-HBc IgG HBsAg ant-HBc IgM 抗-HBs 4 12 16 36 52 8 28 100w 0 20 24 32 乙肝核心抗体IgG (HBcAb-IgG) • 高浓度的HBcAb表示现行感染，常与HBsAg并存,主要是IgM，伴肝损伤,肝功能指标异常。 • 低浓度的HBcAb表示过去感染，常与HBsAb共存，主要是IgG，无肝损伤或已静息。 • HBcAb包括IgM，IgA和IgG，在感染中依次出现和消失，IgG长期存在。

  45. 乙肝核心抗体 (HBcAb-IgG，IgM) Ant-HBc IgM ： 是诊断急性乙型肝炎和判断病毒复制活 跃的指标，并提示病人血液有强传染性。Ant-HBc IgM（+）也可见于慢性活动性肝炎。 Ant-HBc IgG ： 高滴度表明机体正感染HBV； 低滴度Ant-HBcIgG，则是既往感染过 HBV的指标，具有流行病学的意义。 (非保护性抗体)

  46. HBV血清学检测常见模式的临床意义 HBsAg Positive Negative Anti-HBs — HBe — Anti-HBe — Anti-HBc — Pre-S1 — Anti-HBs ＋ HBe — Anti-HBe —/+ Anti-HBc ＋ Pre-S1 — Anti-HBs + HBe — Anti-HBe — Anti-HBc — Pre-S1 — Anti-HBs -HBe +/- Anti-HBe -/+ Anti-HBc + Anti-HBcM +Pre-S1 +/- Anti-HBs — HBe — Anti-HBe —/+ Anti-HBc + Pre-S1 — Anti-HBs —/+ HBe —/+ Anti-HBe +/— Anti-HBc + Anti-HBcM — Pre-S1 —/+ 慢性感染 急性乙肝趋向恢复或慢性乙肝，弱传染性 无HBV感染 易受感染者 2.4.5急性乙肝康复期，开始产生免疫力（由于过去感染而获得免疫力） 2.5急性HBV感染康复期或有既往感染史,有免疫力 接种HBV疫 苗或HBV感 染后康复 有5 种可能的情况 急性或慢性乙型肝炎，高传染性 1. 急性感染的恢复期，弱传染性 2. 接种疫苗的纯度很低 3. 易感者，anti-HBc试验假阳性 4. HBsAg 变异或水平低于检测范围 5. 急性HBV感染“窗口期”， 或既往曾感染过乙肝

  47. 肝炎的诊断、筛查和监测指标

  48. HBV少见模式的诠释 一.HBsAg少见模式的临床解释 • 1. 慢性乙肝病人HBsAg阴性： • * 同时伴有其他的肝炎病毒感染，例如HCV感染； • * 浓度低于检出线 • 跟进检查： • & 重复检测HBsAg • & Anti-HBc、HBeAg、 ALT 、DNA 可能是由于HBsAg的变异所致

  49. HBV少见模式的诠释 一. HBsAg少见模式的临床解释 • 2. 单独的HBsAg阳性： • * 感染的极早期 • * 免疫抑制的患者，免疫应答延迟 • 跟进检查： • 重复检测HBsAg • 检测HBsAg 确认试验 • 2周后跟进检测

  50. HBV少见模式的诠释 二.HBsAg与Anti-HBs同时出现 • 可能为抗HBs产生的早期 • 病人处于HBV感染的恢复期 • 存在HBV的突变，常见于： 1. 新生儿母婴感染 2. 肝移植的患者 • IFNα治疗出现 HBsAb 血清转换

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