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猪 2 型圆环病毒 ORF2 基因的原核表达. 猪 2 型圆环病毒（ PCV2 ）是断奶仔猪多系统衰竭综合征（ PWMS ）的病原，其不但可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡，还与仔猪 A2 型先天性震颤（ CT ）、成年猪皮炎肾炎综合征（ PDNS ）和呼吸道疾病综合征（ PRDS ）有关，更为严重的是 PCV2 的感染可以造成免疫抑制，引起其他各种病原的继发感染，造成的间接损失难以估计。 目前， PCV2 已经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一.
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猪2型圆环病毒（PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PWMS）的病原，其不但可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡，还与仔猪A2型先天性震颤（CT）、成年猪皮炎肾炎综合征（PDNS）和呼吸道疾病综合征（PRDS）有关，更为严重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他各种病原的继发感染，造成的间接损失难以估计。猪2型圆环病毒（PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PWMS）的病原，其不但可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡，还与仔猪A2型先天性震颤（CT）、成年猪皮炎肾炎综合征（PDNS）和呼吸道疾病综合征（PRDS）有关，更为严重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他各种病原的继发感染，造成的间接损失难以估计。 • 目前，PCV2已经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一
PCV2全基因为1 767 bp或1 768 bp，共有11个阅读框，其中ORF1和ORF2是其最主要的阅读框。ORF1为945 bp，编码315个氨基酸，编码病毒的复制蛋白，与PCV1的ORF1编码的蛋白有相同的抗原性。ORF2为702 bp，编码234个氨基酸，编码PCV2的结构蛋白-壳蛋白Cap，具有较好的免疫原性。ORF2的氨基末端区域的12～18和34～41位氨基酸对核定位起重要作用，而69～83和117～131位氨基酸所形成的位点对PCV2抗血清有特异性。
本研究利用PCR手段，对ORF2序列(AB246193)进行扩增。由于ORF2序列中包含疏水序列，难于进行原核表达，故将其基因序列除去疏水性碱基后约580bp克隆入pET-32a Vector，在BL21-ΔE3中用IPTG进行诱导表达。然后通过SDS-PAGE对表达蛋白进行检测。测序及western blot检测表达产物的正确性。PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的顺利表达，为研制PCV2的ELISA检测方法及其抗体制备奠定了基础。
PCV2的DNA提取 • 按TaKaRa公司DNA提取试剂盒说明进行。
引物设计 • GenBank基因库中已登录 • 用Primer Premier 5.0软件 ORF2引物序列设计如下： • P1：5’-TTA GGA TCC CAA TGG CAT CCT CAA CAC-3’ • P2：5’-TTA AAG CTT AGG GGT TAA GTG GGG-3’ • 为了便于克隆在引物P1中引入了BamHⅠ酶切位点，引物P2中引入了HindⅢ酶切 • 位点，同时为了方便表达及表达产物的纯化删去了终止密码子，引物由上海博亚生物技 • 术有限公司合成。稀释为10pmol/μL，－20℃保存备用。
P1：5’-TTA GGA TCCAA TGG CAT CCT CAA CACC-3’ P2：5’-TTA CTC GAGG GGAT TAA GTG GGG-3’
ORF2的PCR扩增： • PCR反应体系(50μL)如下： • Premix Taq 25μL • P1 1μL • P2 1μL • 模板DNA 1μL • ddH2O加至50μL • 混匀后放入PCR自动扩增仪中进行扩增，扩增程序为：94℃预变性2 min；94℃变 • 性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共35个循环；72℃延伸10 min。
PCR产物回收 • (按TaKaRa公司PCR纯化试剂盒说明进行)
目的基因的克隆 • 扩增片段的克隆参照pMD18-T载体克隆试剂盒使用说明，将扩增片段电泳回收后直接进行连接，随后将连接产物转化DH5α感受态细胞，用Amp+挑选阳性克隆。克隆菌用U-gene质粒抽提试剂盒提取质粒DNA，并进行电泳、酶切、PCR扩增和测序鉴定。
PCR产物与pMD18-T载体的连接 • pMD18-T vector的两个3’末端各有一个突出的胸腺嘧啶（T），而TaqDNA酶具有加尾特性（A），可使PCR产物形成粘端，这样使连接效率大大提高。 连接体系如下： 2×rapid ligase buffer 5μL pMD18-T载体(50 ng/μL) 1μL T4 DNA连接酶(3 U/μL) 1μL ddH2O 3μL • 混匀后16℃连接过夜。
感受态细胞的制备 • 从37℃培养过夜的新鲜培养基中挑取DH5α单菌落，接种于3 mL（不含抗生素）LB的培养液中，振荡培养过夜。 • 取50μL过夜培养物，按1:100比例接种于50 mL LB培养液中剧烈振荡培养约3h，至OD600为0.6。 • 无菌条件下，转移细菌培养物至一个无菌且用冰预冷的50 mL离心管中，冰浴10 min冷却。 • 4℃下4000 r/min离心10min，弃上清，倒置离心管沥干液体，加入25 mL 100mmol/Lol/L冰冷的CaCl2溶液，悬浮菌体沉淀，置冰浴放置45 min。 • 4℃下4000 r/min离心10min，弃上清，用2 mL 0.1mol/L冰冷的CaCl 2（可含15%甘油）重悬浮菌体，然后分装于冰冷、无菌的eppendorf管中(100μL/管)，可4℃静置12 h～24 h备用或冻存于－70℃冰箱备长期使用。
重组质粒鉴定 • 在无菌条件下挑取平板上的单菌落，接种于含有 1 mL 液体 LB 培养基(含有浓度为 100 μg/mL 的 Amp)的 1.5 mL Ependorff 管中，在37℃快速振荡(260-280r/min)培养5～6h，取1μL 菌液进行PCR，PCR程序同上，PCR产物经琼脂糖电泳检测，与预计片段大小相近即为目的重组质粒。
重组质粒的酶切鉴定 • 在1.5 mL管中加入： • 10×buffer M 1μL • BamHⅠ（15 U/μL） 0.5μL • HindⅢ（15 U/μL） 0.5μL • 质粒DNA 6μL • ddH2O 加至10μL • 离心混合均匀，37℃作用3.5 h，1.2%琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。鉴定为阳性的重组质粒分别记为pMD18-T-ORF2。
M1 1 2 3 4 M2 2000 1000 750 500 250 100
目的基因的核苷酸序列测定 • 将鉴定过的阳性菌送生物公司进行序列测定，得到目的基因的序列与已报道的序列进行对比分析，并分析对应的目的蛋白的氨基酸序列组成及理论分子量和等电点。
重组ORF2基因原核表达载体的构建 • 将测序正确的pMD18-T-ORF2用BamHⅠ/HindⅢ酶切，电泳，切下含ORF2条带的凝胶，按说明书用DNA回收试剂盒进行回收。 • 原核表达载体PET-32a经BamHⅠ/HindⅢ酶切后胶回收。按常规方法与回收的ORF2连接、转化大肠杆菌BL21-ΔE3 • 质粒经酶切鉴定，筛选重组质粒pET-32a-ORF2送往上海博亚有限公司进行序列测定，以确定所构建的pET-32a-ORF2读码框架的正确性。
重组融合蛋白PET-32a-ORF2的诱导表达及检测 • 重组质粒在大肠杆菌BL21-ΔE3中的表达 • 分别挑取含pET-32a-ORF2的单个转化菌落接种于3 mL 50μg/mL Amp+的LB培养基中37℃过夜培养后，按1:100比例接种于LB培养基中于37℃继续培养3h，至OD600=0.6～1.0，先任取1 mL作为对照，而后加入0.1%的IPTG诱导表达，诱导4h后收获菌体，以备后用。对不同的阳性克隆分别进行诱导表达，筛选出表达量高的克隆。 • 同时诱导含空载体pET-32a的受体菌作为阴性对照。
kDa M 1 2 3 4 5 6 7 97.4 66.2 43.0 31.0 21.0
