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手足口病的病原学及其诊断. 许文波 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 国家麻疹 / 脊灰实验室 2009-03-30. “ 阜阳 13 例不明原因肺炎死亡病例 ”. “疫情概况”. 病例高度散发 不具有传染性，可能为感染性疾病 没有疹子或疹子不典型 以 “ 重症肺炎 ” 为主要临床表现 病情进展迅速，大部分入院几小时 -2 天死亡 病因不明 EV71 感染中枢 神经系统引起的 心肺衰竭. 阜阳 < 不明原因肺炎 > 死亡病原学鉴定. 4 月 18 ，中国 CDC 组织专家组. 分析判定病原和实验室检测方向为 =HEV71. 流行病学.
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手足口病的病原学及其诊断 许文波 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 国家麻疹/脊灰实验室 2009-03-30
“阜阳13例不明原因肺炎死亡病例” “疫情概况” • 病例高度散发 • 不具有传染性，可能为感染性疾病 • 没有疹子或疹子不典型 • 以“重症肺炎”为主要临床表现 • 病情进展迅速，大部分入院几小时-2天死亡 • 病因不明 • EV71感染中枢 神经系统引起的 心肺衰竭
阜阳<不明原因肺炎>死亡病原学鉴定 4月18，中国CDC组织专家组 分析判定病原和实验室检测方向为=HEV71 流行病学 临床资料 实验室检测 证实4月23日 EV71是此次疾病的主要致病原
手足口病第38种需上报的传染性疾病 • 2008.05.02 5 1 2 3 4 手足口病皮疹分布 1. 颊粘膜和手指; 2. 手掌 3. 足底4. 唇粘膜5.咽峡炎
2008年中国大陆手足口病报告人数 传染病疫情网络数据库统计分析 • 总共报告489073例病例，发病率为37.01/100,000 • 严重病例1165例 ，占报告病例数的 0.24 % • 死亡126例，死亡率为0.0095/100,000，死亡病例占总病例 0.26‰
人肠道病毒简介和分类 • 小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）的成员，主要在肠道内复制, 但可感染各个系统和器官。 • 单正链的无包膜RNA病毒，RNA有感染性。 • 小球形病毒（~ 30 nm）， 20面体对称结构。 • 衣壳有VP1-VP4四种蛋白，VP1-VP3分布在表面，VP4与内部RNA结合。 • 与鼻病毒不同的是，它们在酸性环境中稳定。 • 在胞浆增殖，有明显CPE，破胞释放。 • 引起多种疾病：麻痹性疾病、无菌性脑膜炎、心肌损伤、手足口病，结膜炎，皮疹等。
人肠道病毒的毒粒结构 • ~30nm • 二十面体对称 • 无包膜 Courtesy of Linda M. Stannard, University of Cape Town, S.A.h
人肠道病毒发现的历史 • 脊髓灰质炎病毒：通过将标本接种至猴子体内，1909年首次鉴定出该病毒，1949年，利用细胞培养的方法增殖病毒，为疫苗的研制奠定了基础。 • 柯萨奇病毒：1948年在美国纽约Coxsackie镇，将两名麻痹患儿的标本接种至乳鼠体内，分离出来的一组病毒定名为柯萨奇病毒。根据它们在乳鼠上产生的组织病理学变化和在细胞培养上的能力，分为柯萨奇病毒A组和B组。 • 埃可病毒：1951年在一名无症状的儿童的粪便标本中分离到，在细胞培养上可以造成致细胞病变，但对乳鼠和灵长类动物不致病。 • 新肠道病毒：后来，新发现的病毒被按照序号命名（69~71），最近，已经命名至102型
人肠道病毒传播方式 • > 粪-口途径传播: 唾液与粪便 • > 呼吸道传播: 空气飞沫 • 接触传 • 播:
水 洗 排毒 直接、间接接触（院内） 盘子 休闲、娱乐 门把手 河流 灌溉 海产品 污水处理厂 海洋 环境因素影响经水传播的病原体 针对 脊灰病毒、NPEV、 轮状病毒、诺如病毒，甲肝
手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD） • 为全球性传染病，世界大部分地区均有流行的报道。 • 1957年在加拿大首次报告，新西兰Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson从患者粪便和咽拭中分离出CoxA16，同时患者血清抗体有四倍增长,初步查明CoxA16为本病病原； • 1959年提出HFMD命名，HFMD在全球广泛流行，无明显的地域分布。 • 之后世界各地均经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和EV 71引起的手足口病流行。 • 发热, 不适, 咽喉肿痛, 口腔、手、脚侧面及掌心、屁股出现小泡 • 传染性极高 • 病程约1周
HFMD的病原 手足口病可由多种肠道病毒所引起，其中包括 CoxA5,A10, A16, A19, EV71,以及部分埃可病毒和柯萨 奇B组病毒, 以CoxA16 和 EV71最为常见 传播途径: 粪-口途径传播: 唾液与粪便; 呼吸道传播: 空气飞沫;接触传播 疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出。 HFMD为全球性传染病，在全球广泛分布，无明显的地域分布, 但 近年EV71在东南亚一带流行, 引起较多的重症和死亡病例。 在80年代和90年代，中国手足口病的流行主要以 CoxA16为主，2008年，CoxA16 和EV71 共循环引起手 足口病爆发, EV71在大部分省市为优势病毒。
肠道病毒CoxA16 • 1957年在加拿大首次报告HFMD，新西兰Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson从患者粪便和咽拭中分离出CoxA16，同时患者血清抗体有四倍增长,初步查明CoxA16为本病病原； • 1959年提出HFMD命名，之后世界各地均经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒等引起的手足口病
肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71） 属于小RNA病毒科，肠道病毒属，A组肠道病毒。 1972年EV71在美国被首次确认，1974年Schmidt等首次发表从美国加利福尼亚州20例具有中枢神经系统症状患者（1969~1973年）中分离到EV71。 随后，世界上众多国家都有EV71流行的报道。 EV71感染可引起HFMD、疱疹性咽峡炎、无菌性脑炎、脑膜炎和脊髓灰质炎样麻痹，但更多情况下是产生隐性感染。同脊灰病毒相似，EV71对脊髓前角细胞具有一定的组织嗜性，是最常见的引起急性迟缓性麻痹（acute flaccid paralysis，AFP）的非脊灰肠道病毒（non-polio enterovirus，NPEV）,EV71潜伏期一般为3－7天。 感染EV71后，患者发病1~2周内可自咽部排出病毒，从粪便中排毒可持续至发病后3~5周。 疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出。
虽然EV71最初分离于具神经系统症状患者，曾在澳大利亚、欧洲、亚洲和美国引起严重神经系统疾病，而近年来，EV71则多与HFMD的暴发相关，并在暴发中引起患者神经系统症状，甚至死亡。虽然EV71最初分离于具神经系统症状患者，曾在澳大利亚、欧洲、亚洲和美国引起严重神经系统疾病，而近年来，EV71则多与HFMD的暴发相关，并在暴发中引起患者神经系统症状，甚至死亡。 1975年保加利亚44个婴幼儿死于HFMD 20世纪90年代后期，EV 71开始肆虐东亚地区。1997年马来西亚发生了主要由EV 71引起的手足口病流行，4～8月共有2628例发病，仅4～6月就有29例病人死亡，死者平均年龄1.5岁。 1998年我国台湾省发生EV 71引起的手足口病和疱疹性咽峡炎暴发流行，在6月和10月两波流行中，共监测到129106例，重症病人405例，死亡78例，死亡病例大多为5岁以下的儿童，并发症包括脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性迟缓性麻痹和心肌炎等。
进入途径 口腔/呼吸道 咽喉及下肠胃道 传播 飞沫、接触、饮食 扁桃体、深层淋巴结、肠道淋巴结 先天性感染 微病毒血症 肝脏、 胰脏、 肾上腺 心脏 神经系统 呼吸系统 皮肤及黏膜 肌肉 病毒血症 神经系统 抗体产生、病毒血症消失，病毒感染症状改善 人肠道病毒感染的一般致病机制
致病特点 ①隐性感染多见，很少引起腹泻，婴幼儿、免疫力低下的成人易感。 ②病毒在机体肠道中增殖，很少引起肠道症状，是以消化道为原发灶的全身感染。 ③不同人肠道病毒可引起相同症状，同一种人肠道病毒可引起不同临床表现。 ④感染过程中形成病毒血症。
中国HFMD的流行 • 1981年，我国在上海首次报道了HFMD病例 • 1987年在中国分离到CVA16 • 1995年以来，我国陆续在武汉、深圳、上海、重庆、山东和安徽等地的HFMD患者中分离到EV71病毒。 • 2007年，山东发生了手足口病爆发流行，累计报告HFMD病例39，606例，其中14例病例死亡。实验室检测发现EV71是引起山东临沂HFMD的主要病原，同时还检测到Echo3 和/或 CVA16。 • 2008年全国出现HFMD爆发流行,以HEV71为优势,CVA16还有其它EV共循环引起
EV71毒株各个基因型/亚型流行的地理和年代分布EV71毒株各个基因型/亚型流行的地理和年代分布
标本采集种类、运输和保藏-HFMD （一）粪便标本 采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5～8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 （二）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测。采集时间为出现神经系统症状后3日内，采集量为1.0～2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 （三）血清标本 采集急性期(发病0～5天)和恢复期(发病14～30天)双份配对血清用于抗体检测。检测IgM时，采集 (发病7～20天)血。静脉采集3～5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于－20℃以下冰箱中冷冻保存。
（四）咽拭子标本 采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（细胞维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。 （五）疱疹液 可同时采集多个疱疹作为一份标本，用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。
手足口病病例标本采集要求 备注：（1）采集新发或新入院病人的相关标本；（2）样品采集时，如果标本需分装或分地检测，注意适当增加单份样品采集量；（3）采样时，做好样品登记工作，详细记录病人姓名、性别、年龄、发病时间、出疹时间，采样时间、主要临床表现、是否用药等信息，并注意和个案调查资料相匹配。
标本采集注意事项 • 用于病毒分离的标本包括粪便、咽拭子和疱疹液 • 如果患者出现神经系统症状，应该采集脑脊液标本。 • 在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分 • 离病毒具有很高的诊断价值。 • 用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中， • 如维持液或生理盐水，以防干燥。 • 为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例 • 发病后尽早采集，尽快检测。 • 不能立即检测的标本应冷冻保存。 • 对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采 • 集，恢复期血清在发病2-4周后采集。
加强HFMD病原检测和监测的十分必要 • 依据台湾1998-2008和中国大陆2007-2008年的经验 • 掌握手足口病病原谱，特别是EV71感染所占的比例，对分析 • 判断HFMD疫情导致重症和死亡的比例有重要的科学参考价值。 • 1998年台湾手足口病暴发疫情中，在48.7%轻症病例中、75％住院 • 病例中、92％死亡病例中均分离到HEV71。 • 2. 2007年山东临沂发生了手足口病暴发，有8例死亡病例，手足口病的病原谱构成中，HEV71约占84%，CVA16约占16%；2008年当地手足口病病例数仍较高，但病原谱发生较大的变化，病毒毒株是以CVA16为主（占62％）,并且没有重症死亡病例。 • 3. 2008年阜阳HEV71手足口病99 ％以上有是
手足口病的病原构成比例(实验室EMAIL统计) • 严重病例： • EV71 占 实验室确诊的严重病例的81.59％ • 死亡病例： • EV71 占 实验室确诊的死亡病例的96.43％
手足口病的实验室检测 手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病毒鉴定，如果没有采到合格的临床标本，或无法进行实验室检测。 很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流行株也不同。 通常用于肠道病毒分离的细胞系为RD、HEp-2、Vero等，联合使用上述的两种或更多细胞有助于分离到更多的肠道病毒。
病毒实验室检测类型-病毒实验室诊断方法 检测抗体/抗原 蛋白印迹 免疫荧光 ELISA/HI/PA 每种方法 各有优势, 依据病毒 来定检测策略 中和试验 基因芯片 检测病毒 中和试验 病毒分离 ELISA 免疫荧光 电镜 检测核酸 实时荧光定量PCR RT-PCR New molecular tools for epidemiology studies and diagnosis LAMP 基因芯片 套式PCR
待检标本 测双份血清 中和抗体滴度 RT-PCR Real time RT-PCR 检测病毒核酸 序列测定 病毒分离 CPE阳性 无CPE 中和定型 RT-PCR 及序列测定 常规实验 补充实验 非肠道病毒 肠道病毒 手足口病的实验室检测流程见下图：
实验室诊断原则 • 人肠道病毒在自然界广泛存在且种类繁多，一病多原、一原多症是肠道病毒感染的重要特征。因而应对血清诊断及病原诊断的实验室结果作严格评价，必须结合临床症状及环境因素流行病学分析，以确立病毒与疾病的病原学关系。 • 一般采取的原则为： • （1）病毒分离阳性率远高于对照人群； • （2）病程中有特异性抗体变化并排除其他病毒感染； • （3）从病变组织中分离出病毒或检测到病毒核酸。
病毒疾病常出现的阴性结果分析 > 血清抗体： - 血清标本采集时间不对 - 非特异性抑制物质干扰 - 抗体反应微弱：抗原变异 - 病毒或病毒株选择错误 - 检测方法错误 - 实验室质量控制： - 其他 > 病毒培养： - 标本采集时间太迟 - 标本采集部位错误 - 标本采集技术不过关 - 标本保存不好 - 病毒培养细胞株选择错误 - 实验室质量控制 - 其他
造成人肠道病毒感染与流行的因素 • 宿主因素：营养、卫生、抵抗力 • 病毒的种类 • 侵入易感个体的人肠道病毒量 • 病毒的毒性强弱 • 整个族群里含有抗体的个体（群体免疫） • 少数研究：特定HLA基因较易出现肢体麻痹症候群 • 有些研究：新生儿与婴儿易遭受严重的柯萨奇B型 、 ECHO和EV71病毒感染
0 8 16 24 粪便 咽拭 CSF 病毒分离 粪便 双 份 血 血清 抗体 传染性 粪-口 2 - 7 (10) 天 临床特征 0 8 16 24 感染 天 人肠道病毒感染后的病程
人肠道病毒病例死亡时间 早期死亡 晚期死亡 死 亡 机 率 呼吸衰竭 神经系统损伤 心衰竭 脑死亡及 中枢衰竭 1 2 3 4 5 6 14 >28 天
症状 脊灰 Cox A Cox B Echo 麻痹性疾病 + + + + 脑膜炎-脑炎 + + + + 心肌炎 + + + + 新生儿疾病 - - + + 胸膜痛 - - + - 咽峡炎 - + - - 发热性疾病 - + + + 出血性结膜炎 . - + - - 呼吸系统感染 + + + + 不明原因发热 + + + + 糖尿病/胰腺炎 - - + - 5，与人肠道病毒感染相关的疾病
脊髓灰质炎 柯萨奇病毒 埃可病毒 1-34型 新型肠道病毒 临床表现 A组 B组 神经系统： 无菌性脑膜炎 Ⅰ-Ⅲ型 多个型别 1-6 多个型别 71 麻痹型 Ⅰ-Ⅲ型 4.7.9 2-5 2.4.6.9.11.30 70.71 脑炎 2.5-7.9 1-5 2.6.9.17.19 71 皮肤和粘膜： 疱疹性咽峡炎 2-6.8.10 手足口病 5.9.10.16 71 皮疹 多个型别 1.3.5 2.4.6.9.11.16.18 心脏和肌肉： 胸痛 9 1-5 1.6.9 心肌炎 4.16 1-5 1.6.9.19 眼： 急性出血性结膜炎 24 70 呼吸系统： 感冒 21.24 1-3.4.5 4.9.11.20.25 肺炎 4.5 68 消化系统： 18.20-22.24 腹泻 18.20 4.9 肝炎 5 4.9 72 其他： 发热 1-6 新生儿全身感染 Ⅰ-Ⅲ型 1-5 3.4.6.9.17.19 糖尿病 3.4.5 人肠道病毒感染的临床表现
引起的疾病 • 麻痹性疾病 – 脊灰病毒是最常见的引起麻痹性疾病的病原体，但 其它病毒有时也可引起，如肠道病毒71型（EV71） • 无菌性脑膜炎 – 所有人肠道病毒都可以引起, 尤其常见于 5岁以下儿童； • 脑炎 –典型或者不典型的脑炎可能伴有脑膜炎症状．大 部 分病例恢复后不留后遗症； • “不明原因”发热 –由A组柯萨奇病毒（Cox A16）和EV71引起，但 B组柯萨奇病毒和某些埃可病毒也经常造成暴发； • 咽峡炎– 由A组柯萨奇病毒引起； • 传染性胸膜痛(博恩霍尔姆氏病 ，Bornholm disease) • – 通常由B组柯萨奇病毒引起；
心肌炎- B组柯萨奇病毒是最常见的原因，有时其它人肠道病毒也可引起。新生儿感染易引起死亡； • 呼吸道感染– 许多人肠道病毒是引起普通感冒的病原体； • 似风疹的出疹– 许多A组柯萨奇病毒、B组柯萨奇病毒和埃可病毒都可以引起类似风疹的出疹性疾病； • 新生儿感染– 一些B组柯萨奇病毒和埃可病毒可以引起新生儿感染。可能在生产过程受到感染，感染后的症状不尽相同，轻者如发热，重者可发生严重的多系统疾病，甚至死亡； • 结膜炎– 与许多人肠道病毒感染有关，尤其是柯萨奇病毒A24（CoxA24）和肠道病毒70型（EV70）(出血性结膜炎)； • 胰腺炎/糖尿病– 与B组柯萨奇病毒感染有关。
