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ALTERNATIVAS A LA TUBERCULINA

ALTERNATIVAS A LA TUBERCULINA. Servei de Microbiologia. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol. Introducción. 8 millones de nuevos casos cada año, el 95% en paises en vías de desarrollo 2 millones de personas mueren anualmente 1/3 de la población mundial está infectada.

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ALTERNATIVAS A LA TUBERCULINA

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  1. ALTERNATIVAS A LA TUBERCULINA Servei de Microbiologia. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol

  2. Introducción 8 millones de nuevos casos cada año, el 95% en paises en vías de desarrollo 2 millones de personas mueren anualmente 1/3 de la población mundial está infectada

  3. Relación huésped-parásito • Llegada de M.tuberculosis a los alveolos pulmonares donde es fagocitado por los macrófagos alveolares. • El bacilo es capaz de multiplicarse en el fagosoma y destruir posteriormente al macrófago. • Los macrófagos segregan citocinas que atraen neutrófilos, linfocitos y macrófagos para que fagociten bacilos extracelulares, así como para generar un foco inflamatorio.

  4. Relación huésped-parásito • Los linfocitos T CD4 específicos se transforman en linfocitos Th1 bajo la influencia de IL-12 secretada por los macrófagos. • Th1 segrega TNF-  que permiten la llegada de más macrófagos, e IFN- que activa a los que están infectados.

  5. Relación huésped-parásito • Los linfocitos T también segregan IFN- para activar macrófagos e IL-12 para que proliferen Th1. • El macrófago sintetiza IL-12 que estimula a las cél NK que también sintetizan IFN-.

  6. Relación huésped-parásito • El IFN- es la citocina efectora clave en el control de la infección micobacteriana mediante la activación de los macrófagos. • IFN- es la citocina esencial en el desarrollo de la inmunidad protectora contra M. tuberculosis. • En combinación con TNF- consigue unos efectos bactericidas del 90% de la concentración bacilar en los tejidos.

  7. Relación huésped-parásito • Sin embargo, mientras se desencadena esta RI innata, los bacilos se van diseminando hacia los nódulos linfáticos regionales y los vasos sanguíneos. • La RI específica consta no tan sólo de la proliferación de T CD4, sino también del estímulo de una sensibilidad retardada tipo IV (que se pone de manifiesto mediante TST).

  8. Relación huésped-parásito • En un 5% puede originarse una enfermedad primaria. • Pero, en un 95% de los casos suele resolverse el complejo primario, quedando M. tuberculosis en estado latente. • En un 5% de estos casos, puede originarse una enfermedad posprimaria de reactivación durante toda la vida del huésped.

  9. Objetivos propuestos paracontrolar la tuberculosis Pautas antibióticas más cortas y con menos efectos secundarios Una vacuna eficaz y accesible a toda la población Métodos diagnósticos rápidos, sensibles y específicos

  10. Métodos diagnósticos • Un diagnóstico rápido y fiable de la tuberculosis constituye un elemento fundamental en las medidas de control de la enfermedad. • Los métodos microbiológicos de referencia en el diagnóstico de la TB continúan siendo el examen microscópico, cultivo y aislamiento de M. tuberculosis y ladetección de sus ácidos nucleicos.

  11. Métodos diagnósticos • Se requiere de métodos diagnósticos para la detección de pacientes con el bacilo latente. • Las personas infectadas con el microorganismo latente representan un peligro potencial de nuevos casos de TB. • La única manera de controlar la TB es interrumpir la cadena de infección.

  12. Tuberculina • La tuberculina (TST) es una prueba de intradermoreacción que permite la detección de individuos infectados: • Evitando el paso de infección a enfermedad. • Rompiendo la cadena de transmisión.

  13. Tuberculina • Evalúa la hipersensibilidad retardada que determinados compuestos antigénicos del bacilo provocan en el infectado. • La tuberculina se obtiene del filtrado del cultivo de M. tuberculosis esterilizado y concentrado. Actualmente está constituido por un derivado proteico purificado (PPD).

  14. Tuberculina CPA Célula T Liberación citocinas Tuberculina Induración visible y palpable. Respuesta inflamatoria. Infiltración perivascular linfomonocitaria.

  15. Inconvenientes Tuberculina • Algunos de los constituyentes proteicos del PPD son compartidos por micobacterias ambientales y por el bacilo vacunal (BCG). • Falta de respuesta en pacientes con alteraciones de la inmunidad celular. • Errores en la administración y subjetividad en la interpretación de los resultados. • Visita de lectura. Conmoción social.

  16. IFN- testNueva estrategia en el diagnóstico de la infección latente • Basándose en el fundamento de la tuberculina se han diseñado nuevas estrategias in vitro para evidenciar la sensibilización de las células T. • Se han empleado diferentes antígenos micobacterianos para la estimulación de las células. • Revelar la sensibilización mediante detección de IFN-.

  17. Fundamento de la tecnología

  18. Fundamento de la tecnología Estimulación antigénica Célula T CPA Liberación IFN- Determinacíon IFN-

  19. Principales antígenos evaluados PPD ESAT-6 y CFP10

  20. Resultados empleando PPD como antígeno 67 ADVP. HIV pos y neg. Mayor concordancia TST y IFN-test en HIV positivos 253 voluntarios Etiopia. 35% concordancia TST y IFN-test 175 Baltimore. 68 % concordancia TST y IFN-test 952 voluntarios 1226 adultos. 390 TST + / 349 IFN- test + TST + / IFN- test -. 7x en vacunados 455 individuos. G1: Inmigrantes G2: Personal Sanitario G3: TBC activa No diferencias en extrapulmonar vs pulmonar ni si baciloscopia positiva Personal sanitario. 20 TST +, 20 TST -

  21. ESAT-6 y CFP-10 • Early Secretory Antigen Target-6. • Culture Filtrate Protein 10. • Proteínas secretadas por M.tuberculosis complex. • No está presente en la mayoría de micobacterias ambientales. • No está presente en el bacilo vacunal (BCG).

  22. Micobacterias ambientales Antígenos ESAT CFP Tuberculosis complex Antígenos ESAT CFP M abcessus - - M tuberculosis + + M africanum + + M avium - - M bovis + + BCG substrain gothenburg - - M branderi - - moreau - - tice - - M celatum - - tokyo - - danish - - glaxo - - M chelonae - - montreal - - pasteur - - M fortuitum - - M gordonii - - M intracellulare - - M kansasii + + M malmoense - - M marinum + + M oenavense - - M scrofulaceum - - M smegmatis - - M szulgai + + M terrae - - M vaccae - - M xenopi - - Especificidad de ESAT-6 y CFP-10

  23. Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10 8 péptidos sínteticos de ESAT-6. Células mononucleares. ELISPOT. En supuestos TST neg: 3 pos/11 (33’8%) 8 péptidos sintéticos de ESAT-6. Células mononucleares. ELISA. Dinamarca. Etiopia. TB: 11/34 (32,5%) Contactos con TB: 14/30 (46’6%) ESAT 6 recombinante. Células mononucleares. ELISA Hª consistente con LTBI en presencia de inmunidad

  24. Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10 Pathan A et al. 2001. J. Immunol. 2001. • Control no expuesto: 0% • Convivientes expuestos: 85% • TBC pulmonar: 88-92% • La frecuencia de linfocitos T antígeno específico (ESAT-6) disminuyen con el tratamiento.

  25. Efecto tratamiento en IFN- RESPUESTA TST IFN- Carga Micobacteriana TIEMPO Infección Enfermedad Rx

  26. Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10 Doherty T et al. J. Clin. Microbiol. 2002. • Convivientes expuestos (24). • Seguimiento de 2 años. • Desarrollaron TBC (7): • TST pos (7), IFN- test pos (6) • No desarrollaron TBC (17): • TST pos (14), IFN-  test pos (3) • Indicador de riesgo de progresión a TBC.

  27. Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10 Arend S. et al. J. Infect. Dis. 2002

  28. Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10 Cardoso F.L. et al. Infect. Immun. 2002. • Resultados positivos del IFN- test: • 60% TBC • 50% Leprosos • 60% Pacientes control • 59% Vacunados (todos TST pos) • 36% de similitud de la ESAT-6 de M.tuberculosis y M.leprae.

  29. Resultados empleando ESAT-6 y CFP-10 Ewer K et al. Lancet. 2003. • ESAT-6 recombinante y 12 pools de proteínas derivadas del ESAT-6 y CFP-10 • 89% de concordancia con la tuberculina. • Correlaciona mejor que la tuberculina con exposición a M.tuberculosis en términos de tiempo (p=0.007) y proximidad (p=0.03). • No correlación con vacunados con BCG (p=0.44).

  30. Estudios comparativos PPD y ESAT-6 ESAT-6: Sangre total y ELISA 19 Vacunados: 9 + por PPD y 2 + por ESAT-6 Vacuna a 60 estudiantes de Medicina. ESAT-6: Sangre total y ELISA

  31. Métodos in vitro estandarizados • QuantiFERON-TB Gold • ELISPOT

  32. QuantiFERON-TB Gold • El QuantiFERON- TB Gold (QFN) es un método basado en la estimulación de sangre total mediante ESAT-6 y CFP-10. • Determinación de la síntesis de IFN- por las células T sensibilizadas mediante técnica de ELISA.

  33. Nil Control ESAT-6 CFP-10 Mitogen Control Incubar overnigth a 37oC Los individuos infectados por TB responden secretando IFN-g Extracción Transferir sangre total sin diluir en los pocillos de una placa de cultivo y añadir antígenos. Tiempo límite para el procesamiento de la muestra: 12 horas Fase 1: Estimulación linfocitos T

  34. Recoger el plasma del sobrenadante de las células e incubar 120 min en un ELISA tipo ‘Sandwich’ Lavar, añadir Substrato, incubar 30 min y parar la reacción COLOR Determinación niveles de IFN-g Curva Standard TMB OD 450nm IFN-g IU/ml Fase 2: Determinación de IFN-

  35. ELISPOT • Método basado en la estimulación de células monocíticas extraidas de sangre periférica mediante la proteína ESAT-6. • Determinación de la síntesis de IFN- por las células sensibilizadas mediante técnica de ELISPOT.

  36. ELISPOT Medio de cultivo con células y el antígeno Anticuerpos específicos fijados a membrana

  37. ELISPOT 24-28 horas a 37ºC. CO2

  38. ELISPOT - Anticuerpo secundario. 2’5h. TA. Humedad. - Streptavidina-HRP. 2h. TA

  39. ELISPOT - Añadir sustrato cromogénico. - Incubar 15-70’ a TA.

  40. Lectura de los resultados • Se considera positivo si el pocillo de la muestra contiene una media de 5 spot-forming cells más que el control negativo.

  41. CDC Guidelines para la utilización del QFN • El test de la tuberculina y el QFN no detectan los mismo componentes de la respuesta inmune. • Debe ser utilizado en laboratorios con experiencia en el test.

  42. Utilización Personas con elevado riesgo de infección latente. Personas con bajo riesgo de infección tuberculosa y sin factores predisponentes. RecomendacionesCDC Guidelines para la utilización del QFN

  43. RecomendacionesCDC Guidelines para la utilización del QFN Confirmación del resultado de QFN • Bajo riesgo: QFN pos requiere confirmación por tuberculina. Si TST neg no quimioprofilaxis. • Alto riesgo: QFN pos requiere confirmación por tuberculina. Si TST neg, quimioprofilaxis a juicio clínico. • QFN neg no requiere confirmación.

  44. ContraindicacionesCDC Guidelines para la utilización del QFN • En personas con sospecha de TB activa. • En estudio de contactos de tuberculosos. • Niños y jóvenes < 17 a., embarazadas, o personas con patologías subyacentes que aumenten el riesgo de progresión a TB. • No test confirmatorio de la tuberculina.

  45. Ventajas de esta tecnología • No subjetividad en la interpretación. • Posibilidad de repetir determinaciones. • Resultados rápidos. • Se elimina la visita de lectura. • Controles de falta de respuesta inmune. • De fácil estandarización. • No interferencia con la vacuna BCG.

  46. Antígenos lipídicos y glicolipídicosUlrichs T. et al. 2003 • Se ha descrito un subtipo de cél T dependientes de moléculas CD1. Estas moléculas presentan antigenos lípidos y glicolipídicos. Las T que reconocen estos antígenos también producen IFN-. • Mayor respuesta frente a estos antígenos en individuos TST pos que en TST neg. • Mayor respuesta en tuberculosos a las dos semanas de tratamiento que en el momento del diagnóstico.

  47. Conclusiones finales • La detección de la infección tuberculosa mediante el test de la tuberculina es imperfecta. • Se han realizado esfuerzos para la estandarización de técnicas in vitro basadas en la respuesta inmunológica del huésped frente al patógeno.

  48. Conclusiones finales • Las técnicas actualmente disponibles se muestran como una posible alternativa al test de la tuberculina. • Las investigaciones han de ir encaminadas a identificar nuevos antígenos específicos de M.tuberculosis para desarrollar técnicas in vitro para el diagnóstico de la infección tuberculosa aún más eficaces.

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