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硝酸还原酶活性 的测定（活体法）

实验四. 硝酸还原酶活性 的测定（活体法）. （综合性实验）. 实验目的. 熟悉硝酸还原酶活性 测定的方法。. 实验原理. 硝酸还原酶（ NR) 是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关，它作用于 NO 3 - 使之还原为 NO 2 - ，其反应式为： NO 3 - +NADH+H + →NO 2 - +NAD+H 2 O 产生的 NO 2 - 可以从组织内滲透到外界溶液，并积累在溶液中，测定反应液中 NO 2 - 含量的增加，即表现该酶活性的大小。这种方法简单易行，在一般条件下都能做到。. 实验原理.

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硝酸还原酶活性 的测定（活体法）

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Presentation Transcript

  1. 实验四 硝酸还原酶活性 的测定（活体法） （综合性实验）

  2. 实验目的 熟悉硝酸还原酶活性 测定的方法。

  3. 实验原理 硝酸还原酶（NR)是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关，它作用于NO3-使之还原为NO2-，其反应式为： NO3-+NADH+H+→NO2-+NAD+H2O 产生的NO2-可以从组织内滲透到外界溶液，并积累在溶液中，测定反应液中NO2-含量的增加，即表现该酶活性的大小。这种方法简单易行，在一般条件下都能做到。

  4. 实验原理 NO2-含量的测定用磺胺［对氨基苯磺酸胺（sulfanil-amide）］比色法。 在酸性溶液中磺胺与NO2-形成重氮盐，再与α-萘胺偶联形成紫红色的偶氮染料。反应液的酸度大，则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。 增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。 这种方法非常灵敏，能测定每毫升含0.5μg的NaNO2。

  5. 实验材料 新鲜的植物叶片

  6. 设备 722型分光光度计、真空泵、真空干燥器、恒温箱、电子天平、镊子、三角瓶、烧杯、试管、试管架、吸水纸、擦镜纸、移液管、剪刀、吸耳球。

  7. 方法步骤 • 标准曲线的绘制 1. 吸取不同浓度的NaNO2溶液（0.5，1，2，3，4，5µg/ml）2ml于试管中，加入磺胺试剂4ml及α-萘胺试剂4ml，混合均匀 。

  8. 1.反应液的配制

  9. 2. 30℃恒温箱中保温30min; 3.在520nm波长处准确测OD值; 4.以OD值为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标，绘制标准曲线； 5.将上周所测的OD值在标准曲线上查出相应的NO2-浓度； 6.代入公式计算酶的活性。

  10. [NO2-]处理－ [NO2-]对照 NR活性 (μg· NO2- /g·h) = × 10 材料鲜重（g）×时间（h） • NO2-含量的测定 ①取材 新鲜植物叶片→水洗→吸干→称重（0.2g/份，2份)。 A.对照：0.1mol/LH3PO4(pH7.5)缓冲液5ml+DW5ml B.处理：0.1mol/LH3PO4(pH7.5)缓冲液5ml+0.2mol/LKNO35ml • ②抽气 3min/次，2次； • ③酶促反应：30℃恒温箱中保温30min ； • ④显色反应 ：处理、对照、蒸馏水各2ml分别加入磺胺4ml、α-萘胺4ml（二者顺序不可颠倒），于3支试管中摇匀，30℃下20min； • ⑤用分光光度计在520nm波长处测OD值； • ⑥查标准曲线； • ⑦计算：

  11. 思考题 • 取材前为什么要进行一段时间的光照？ • 为什么要设置对照？ • 为什么要抽气？ • 酶促反应为什么要避光保温？ • 为什么要在520nm处测吸光值？

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