Fluorescenční a fotoaktivovatelné sondy

1. Fluorescenční a fotoaktivovatelné sondy Jaroslava Hniličková

2. Co jsou to fluorescenční metody, možnosti jejich použití • Vlastní a nevlastní fluorescence • Fluorescenční značky • Fluorescenční sondy • Příklady použití fluorescenčních sond

3. Fluorescence Fluorescence- schopnost některých látek po ozáření - excitaci světlem určité vlnové délky vyzařovat - emitovat světlo jiné vlnové délky Stokesův posun Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima Emitované záření má větší vlnovou délku (nižší energii)

4. Fluorescenční metody, možnosti použití Využití fluorescence • Biochemický a biofyzikální výzkum • Enzymové reakce, transport membránou, přenos signálu, studium neurotransmiterových receptorů a iontových kanálů, hledání vazebného místa v biomolekule • Klinická chemie • Genetické analýzy, genetické manipulace • Analýza DNA • Biomedicína • Nahrazení metod využívajících radionuklidové zářiče Výhoda – možnost studia pochodů v živých buňkách

5. Výhody fotoafinitních sond Afinitní sondy – nevýhody: možnost deaktivace, hydrolýzy ještě před navázáním na vazebné místo možnost interakce na jiném než vazebném místě Fotoaktivovatelná sonda: Chemicky inertní sonda chemicky reaktivní ozáření

6. Používané přístroje Přístroje: • Fluorimetry • Spektrofluorimetry • Fluorescenční skenery • Fluorescenční mikroskopy • Průtokové cytometry Princip přístrojů využívajících fluorescenci

7. excitační monochromátor vzorek zdroj emisní monochromátor detektor čtecí zařízení Měření fluorescence Fluorimetr Jenway řady 6200

8. Fluorescenční mikroskopy Fluorescenčnímikroskop XFT 313 FL 2002 K – Fluorescenčnímikroskop

9. Software Leica Application Suite Advance Fluorescence je modulární systém pro základní i profesionální práci s fluorescenčním obrazem.

10. . Endotelové buňky pod mikroskopem Fluorescenční mikroskop se třemikanály umožňuje zobrazení jednotlivých částí buňky (mitochondrie, cytoskelet, jádro)

11. Vlastní a nevlastní fluorescence • Vlastní fluorofory (vnitřní, intrinsic) • vyskytují se přirozeně • Proteiny (aromatické aminokyseliny, např. fenylalanin), vitamin A, cytochromy, hemoglobin, chlorofyl • Nevlastní fluorofory (vnější, extrinsic) • jsou přidány ke vzorkům, které nemají vhodné fluorescenční vlastnosti • Použití nevlastních fluoroforů je mnohem častější než použití vlastních

12. Nevlastní fluoroscence • Fluorescenční značky • látky přidané ke studovanému vzorku, které se váží kovalentně • fluorescenční značení proteinů • Fluorescenční sondy • látky přidané ke studovanému vzorku, které se váží nekovalentně • Požadované vlastnosti • specifická vazba na buněčné složky • citlivost emise na změny v okolí • podobnost s původní sloučeninou • po zavedení fluoroforu nesmí dojít k narušení biologických systémů

13. Principy fotoafinitního značení • Biologicky aktivní • Chemicky stálé bez přítomnosti světla – možnost skladování • Stálé v podmínkách experimentu • Krátký poločas – minimalizace nespecifického značení • Vysoká specificita • Snadná syntetická dostupnost • Stálost aduktu v podmínkách použitých analytických technik (elektroforéza, hmotnostní spektrometrie)

14. Principy fotoafinitního značení Fotoreaktivní skupina – modrá Radioizotop – červený Protein - zelený

15. Chemické struktury barev Alexa

16. Emisníspektra pro Alexa Fluor barevné serie

17. Alexa Fluor Cadaverine 647

18. Syntéza AFCS DCC: Dicyklohexylkarbodiimid, CMO.HCl: karboxymethyloxim hydrochlorid, NHS: N-Hydroxyskcinimid

20. Specifičnost absorpce AFCS Absorpce fluoroforu AF647 minimální ve srovnání s absorpcí AFCS Snažší absorpce způsobena CS částí molekuly

21. Rychlá absorpce AFCS Šipky ukazují endosomy označené AFCS

22. Pohyb AFCS v buňkách Signál AFCS se rychle ztrácí z PM a akumuluje se ve vakuolách

23. Pohyb AFCS v buňkách AFCS je v PM, endozomech (označeno šipkami) a hromadí se ve vakuolách

24. AFCS putuje z PM do vakuol

25. Význam AFCS Vývoj bioaktivního fluorescenčně značeného brassinosteroidu BR Alexa Fluor 647 kastasteron (AFCS) umožňuje pozorování endocytózy komplexů BR1-ligandu v živých buňkách. Užitím různých endomembránových značek lze mapovat endocytickou cestu komplexu BRI1-AFCS z plasmatické membrány do vakuol.

26. Příprava steroidu pro navázání Alexy

27. Příprava steroidu pro navázání Alexy

28. Příprava aktivního esteru Alexy ethyldiisopropylamine, (O-(N-succinimidyl)-1,1,3,3 tetramethyluronium tetrafluoroborate, H2O, DMF, 0 °C

29. Alexa navázaná na steroid

31. DHEA (1), Photo-DHEA (2), a DHEA-Bodipy (3)

32. Další fluorofory 7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol

33. b BODIPY Skupinafluorescenčních značek, jejichž fluorofor obsahuje bór Použití: značení proteinů, nukleotidů, enzymových substrátů, mastných kyselin, fosfolipidů boron-dipyrromethene 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene

34. Struktury BODIPY

35. Dansylchlorid Reaguje s volnými aminoskupinami proteinů DNS-Cl 5-dimethylaminonaftalén-1-sulfonyl chlorid

36. Fluorescentní steroly pro studium pohybu cholesterolu v živých buňkách

37. Závěr Využití fluorescence – nedestruktivní způsob sledování a analýzy biologických molekul prosřednictvím fluorescenční emise o určité frekvenci. Existuje velká řada vnějších fluoroforů, takže je možnost výběru toho nejvhodnějšího. Přehled je možno nalézt na stránkách www.molecularprobes.com

38. Literatura Gimpl G. Gehrig-Burger K.: Probes for studying cholesterol binding and cell biology. Steroids 76 (2011) 216–231 Waschatko G. et al.: Photo-DHEA—A functional photoreactive dehydroepiandrosterone (DHEA) analog. Steroids, 76 (2011), 502-507 Irani N. G. et al.: Fluorescent brassinosteroids trace the endocytic route of BRI1, k tisku Borovska J. et al.:. Neurosteroid access to the NMDA receptor, k tisku www.molecular probes.com

39. Děkuji za pozornost