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基因表达调控的基本概念 原核基因调控机制 乳糖操纵子 色氨酸操纵子 其他操纵子 转录后水平上的调控. Contents. 第三节 乳糖操纵子 (lac operon). 内容提要: 乳糖操纵子的结构 酶的诱导 —— lac 体系受调控的证据 乳糖操纵子调控模型 影响因子 Lac 操纵子中的其他问题. 一、 大肠杆菌乳糖操纵子的结构. 7. 结构基因. 调节基因 启动区 promoter. 操纵区 operator. 阻遏子 I 启动子 P. 控制子 O. Z. Y. A. 转录方向和范围 β- 半乳糖苷透过酶. β- 半乳糖苷
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基因表达调控的基本概念 原核基因调控机制 乳糖操纵子 色氨酸操纵子 其他操纵子 转录后水平上的调控 Contents
第三节 乳糖操纵子(lac operon) 内容提要: 乳糖操纵子的结构 酶的诱导——lac体系受调控的证据 乳糖操纵子调控模型 影响因子 Lac操纵子中的其他问题
一、大肠杆菌乳糖操纵子的结构 7 结构基因 调节基因启动区 promoter 操纵区 operator 阻遏子I启动子P 控制子O Z Y A 转录方向和范围 β-半乳糖苷透过酶 β-半乳糖苷 乙酰基转移酶 β-半乳糖苷酶 将乳糖水解成 半乳糖和葡萄糖 使乙酰基转移到β-半乳 糖苷形成乙酰半乳糖 使乳糖进入 细胞内 必需
Z编码β-半乳糖苷酶:将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖或水解其他β-半乳糖苷酶Z编码β-半乳糖苷酶:将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖或水解其他β-半乳糖苷酶 Y编码β-半乳糖苷透过酶:使外界的β-半乳糖苷(如乳糖)能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。 A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶:乙酰辅酶A上的乙酰基转到β-半乳糖苷上,形成乙酰半乳糖。
二、酶的诱导——lac体系受调控的证据 mRNA或 酶的量 32P标记的mRNA 与模板DNA杂交 来检测 β-半乳糖苷酶 lacmRNA 透过酶 蛋白质半衰期长 而较为稳定 时间/min 1min 在无葡萄糖培养基 中加入乳糖 去掉乳糖
12 安慰诱导物(高效诱导物) 用含硫的乳糖类似物代替乳糖进行实验 安慰性诱导物,不是半乳糖苷酶的底物,但能诱导酶合成 乳糖 显色底物ONPG IPTG TMG
主要内容: ① Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码 三、乳糖操纵子调控模型(负控诱导模型)
17 多顺反子和单顺反子 多顺反子:见于原核生物,意指一个mRNA 分子编码多个多肽链。这些多肽链对应的DNA 片断则位于同一转录单位内,享用同一对起点 和终点 单顺反子(monocistron):真核基因转录产 物为单顺反子,即一条mRNA模板只含有一个 翻译起始点和一个终止点,因而一个基因编码 一条多肽链或RNA链,每个基因转录有各自的 调节元件
多顺反子和单顺反子 18
② 这个mRNA分子的启动子区(P)位于阻遏基因(I)与操纵区(O)之间,不能单独起动合成β-半乳糖苷酶和透过酶的表达。
③ 操纵基因是DNA上的一小段序列 (仅为26bp),是阻遏物的结合位点。 RNA聚合酶结合部位 阻遏物结合部位
操纵基因位点的回文序列 (结构相同,方向相反的序列)
④当阻遏物与操纵基因结合时,lac mRNA的转录起始受到抑制。
⑤诱导物通过与阻遏物结合,改变它的三维构象,使之不能与操纵基因结合,从而激发lac mRNA的合成。 当有诱导物存在时,操纵基因区没有被阻遏物占据,所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。
1、lac操纵子的本底水平表达 有两个矛盾是操纵子理论所不能解释的: ①诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合,而转运诱导物需要透过酶,后者的合成又需要诱导。 解释:一些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞? 一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成?√ 细胞内原本有少量透过酶 四、影响因子
②真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖,前者是在β-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的,因此,需要有β-半乳糖甘酶的预先存在。②真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖,前者是在β-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的,因此,需要有β-半乳糖甘酶的预先存在。 解释: 本底水平的组成型合成:非诱导状态下有少量的lac mRNA合成。 细胞内原本有少量半乳糖苷酶
培养基:甘油 按照lac操纵子本底水平的表达,每个细胞内有几个分子的β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷透过酶; 培养基:加入乳糖 少量乳糖 2、大肠杆菌对乳糖的反应 β-半乳糖苷酶 透过酶 进入细胞 异构乳糖 诱导物 诱导lac mRNA的生物合成 大量乳糖进入细胞 多数被降解为葡萄糖和半乳糖(碳源和能源) 下一轮循环 异构乳糖
诱导物的加入和去除对lac mRNA的影响 本底水平合成 乳糖存在下的 lacmRNA水平β-半乳糖苷 酶活性 诱导后水平 负控诱导过程 乳糖撤去后的恢复 滞后 去掉诱导物 滞后 本底水平 加诱导物 本底水平
3、阻遏子lacI基因产物及阻遏物 26 lac操纵子阻遏物mRNA在弱启动子控制下组成型合成
27 阻遏子lacI基因产物及阻遏物 阻遏蛋白有四个相同亚基,每个亚基含有 347个氨基酸残基,每个亚基能与一分子 IPTG(乳糖类似物)结合 若lacI基因由弱启动子突变成强启动子, 细胞内不可能产生足够的诱导物克服阻遏状 态,lac操纵子变得不可诱导
如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中, lac操纵子处于阻遏状态,不能被诱导;一旦耗尽外源葡萄糖(箭头处),乳糖就会诱导lac操纵子表达分解乳糖所需的三种酶。 代谢物阻遏效应 4、葡萄糖对lac操纵子的影响
5、cAMP与代谢物激活蛋白 cAMP浓度受到葡萄糖代谢的调节 ATP cAMP(环腺甘酸) 腺甘酸环化酶 培养基缺乏碳源 cAMP浓度高 培养基中含葡萄糖 cAMP浓度低 培养基中只含甘油或乳糖 cAMP浓度高
调控区 结构基因 DNA P O Z Y A Z: β-半乳糖苷酶 Y: 透过酶 A:乙酰基转移酶 操纵序列 启动序列 CAP结合位点 代谢物激活蛋白(CAP)/环腺甘酸受体蛋白(CRP) cAMP—CAP复合物
CRP蛋白形成二聚体 • cAMP装配到CRP二聚体上,形成cAMP-CRP复合物 • RNA聚合酶α亚基的C端结构域(αCTD)可以结合CAP位点, • cAMP-CRP复合物帮助RNA聚合酶结合到启动子区,激活lac转录
CAP CAP CAP CAP CAP CAP + + + + 转录 DNA P O Z Y A CAP的正调控 无葡萄糖,cAMP浓度高时 促进转录 有葡萄糖,cAMP浓度低时 不促进转录
CAP的正调控 葡萄糖 乳糖
36 cAMP-CRP与启动子结合的开放结构 cAMP-CRP复合物与启动子的结合是lac mRNA合成起始所必需的 复合物结合于启动子上游,使DNA弯曲 形成稳定的开放型启动子-聚合酶结构 阻遏物阻止形成开放结构,抑制RNA聚合酶的 功能
Lac操纵子的调控区域-P、O区 37 P区(启动子区)一般是从I基因结束到 mRNA转录起始位点下游5-10bp O区位于-7~+28bp,对称轴+11bp 转录起点 +1 lac 启动子区(P) 阻遏物结合区(O)
1、A基因及其生理功能 五、Lac操纵子中的其他问题 乙酰化抑制了β-半乳糖苷酶产物的有害衍生物在细胞内积累,有利于生物进化 β-半乳糖苷酶 分解产物(体内积累,有害) 半乳糖苷分子 乙酰基 β-半乳糖甘乙酰基转移酶(A基因) 半乳糖苷分子(IPTG) 不能被分解
2、lac基因产物数量上的比较 β-半乳糖苷酶:透过酶:乙酰基转移酶=1:0.5:0.2 翻译水平上受到调节: (1)lac mRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离,从而终止蛋白质链的翻译; (2)在 lac mRNA分子内部,A基因比Z基因更容易受内切酶作用发生降解。
44 3、操纵子的融合与基因工程 操纵子在自然条件下可能发生融合 lac操纵子和pur操纵子(负责嘌呤合成)的偶联 5’ 3’ tsx基因 突变 pur操纵子 pur操纵子 Lac:IPOZYA Lac:IPOZ 基因工程:lac启动子是强启动子,融合后增加其 它蛋白质的合成量
Hey man, I’m constitutive Repressor Promoter LacZ LacY LacA CAP Binding Repressor Repressor Repressor mRNA Operator CAP The Lac Operon:When Glucose Is Present But Not Lactose Come on, let me through RNA Pol. No way!
Hey man, I’m constitutive RNA Pol. Repressor Promoter LacZ LacY LacA X CAP CAP CAP Binding Repressor Repressor Repressor mRNA cAMP cAMP cAMP Repressor Operator CAP The Lac Operon:When Lactose Is Present But Not Glucose Bind to me Polymerase Yipee…! RNA Pol. Lac This lactose has bent me out of shape
Alright, I’m off to the races . . . Hey man, I’m constitutive Repressor Promoter LacZ LacY LacA CAP CAP CAP Binding Repressor Repressor Repressor mRNA cAMP cAMP cAMP Operator CAP The Lac Operon:When Neither Lactose Nor Glucose Is Present Bind to me Polymerase Come on, let me through! RNA Pol. STOP Right there Polymerase
45 小结 乳糖操纵子的结构 负控诱导系统的过程 操纵子模型的具体内容 本底水平的表达 代谢物阻遏效应 cAMP-CRP复合物的作用