一、大肠杆菌乳糖操纵子的结构 7 结构基因调节基因启动区 promoter 操纵区 operator 阻遏子I启动子P 控制子O Z Y A 转录方向和范围 β-半乳糖苷透过酶 β-半乳糖苷乙酰基转移酶 β-半乳糖苷酶将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖使乙酰基转移到β-半乳糖苷形成乙酰半乳糖使乳糖进入细胞内必需

Z编码β-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖或水解其他β-半乳糖苷酶Z编码β-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖或水解其他β-半乳糖苷酶 Y编码β-半乳糖苷透过酶：使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。 A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰辅酶A上的乙酰基转到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。

二、酶的诱导——lac体系受调控的证据 mRNA或酶的量 32P标记的mRNA 与模板DNA杂交来检测 β-半乳糖苷酶 lacmRNA 透过酶蛋白质半衰期长而较为稳定时间/min 1min 在无葡萄糖培养基中加入乳糖去掉乳糖

12 安慰诱导物（高效诱导物）用含硫的乳糖类似物代替乳糖进行实验安慰性诱导物，不是半乳糖苷酶的底物，但能诱导酶合成乳糖显色底物ONPG IPTG TMG

主要内容： ① Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码三、乳糖操纵子调控模型（负控诱导模型）

17 多顺反子和单顺反子多顺反子：见于原核生物，意指一个mRNA 分子编码多个多肽链。这些多肽链对应的DNA 片断则位于同一转录单位内，享用同一对起点和终点单顺反子（monocistron）：真核基因转录产物为单顺反子，即一条mRNA模板只含有一个翻译起始点和一个终止点，因而一个基因编码一条多肽链或RNA链，每个基因转录有各自的调节元件

多顺反子和单顺反子 18

② 这个mRNA分子的启动子区（P）位于阻遏基因（I）与操纵区（O）之间，不能单独起动合成β-半乳糖苷酶和透过酶的表达。

③ 操纵基因是DNA上的一小段序列 （仅为26bp），是阻遏物的结合位点。 RNA聚合酶结合部位阻遏物结合部位

操纵基因位点的回文序列 （结构相同，方向相反的序列）

④当阻遏物与操纵基因结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制。

⑤诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lac mRNA的合成。当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。

1、lac操纵子的本底水平表达 有两个矛盾是操纵子理论所不能解释的： ①诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要透过酶，后者的合成又需要诱导。解释：一些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞？一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成？√ 细胞内原本有少量透过酶四、影响因子

②真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖，前者是在β-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有β-半乳糖甘酶的预先存在。②真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖，前者是在β-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有β-半乳糖甘酶的预先存在。解释：本底水平的组成型合成：非诱导状态下有少量的lac mRNA合成。细胞内原本有少量半乳糖苷酶

培养基：甘油 按照lac操纵子本底水平的表达，每个细胞内有几个分子的β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷透过酶；培养基：加入乳糖少量乳糖 2、大肠杆菌对乳糖的反应 β-半乳糖苷酶透过酶进入细胞异构乳糖诱导物诱导lac mRNA的生物合成大量乳糖进入细胞多数被降解为葡萄糖和半乳糖（碳源和能源）下一轮循环异构乳糖

乳糖

诱导物的加入和去除对lac mRNA的影响 本底水平合成乳糖存在下的 lacmRNA水平β-半乳糖苷酶活性诱导后水平负控诱导过程乳糖撤去后的恢复滞后去掉诱导物滞后本底水平加诱导物本底水平

3、阻遏子lacI基因产物及阻遏物 26 lac操纵子阻遏物mRNA在弱启动子控制下组成型合成

27 阻遏子lacI基因产物及阻遏物阻遏蛋白有四个相同亚基，每个亚基含有 347个氨基酸残基，每个亚基能与一分子 IPTG（乳糖类似物）结合若lacI基因由弱启动子突变成强启动子，细胞内不可能产生足够的诱导物克服阻遏状态，lac操纵子变得不可诱导

如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中， lac操纵子处于阻遏状态，不能被诱导；一旦耗尽外源葡萄糖（箭头处），乳糖就会诱导lac操纵子表达分解乳糖所需的三种酶。代谢物阻遏效应 4、葡萄糖对lac操纵子的影响

5、cAMP与代谢物激活蛋白 cAMP浓度受到葡萄糖代谢的调节 ATP cAMP（环腺甘酸）腺甘酸环化酶培养基缺乏碳源 cAMP浓度高培养基中含葡萄糖 cAMP浓度低培养基中只含甘油或乳糖 cAMP浓度高

调控区 结构基因 DNA P O Z Y A Z： β-半乳糖苷酶 Y：透过酶 A：乙酰基转移酶操纵序列启动序列 CAP结合位点代谢物激活蛋白（CAP）/环腺甘酸受体蛋白（CRP） cAMP—CAP复合物

CRP蛋白形成二聚体 • cAMP装配到CRP二聚体上，形成cAMP-CRP复合物 • RNA聚合酶α亚基的C端结构域（αCTD）可以结合CAP位点， • cAMP-CRP复合物帮助RNA聚合酶结合到启动子区，激活lac转录

CAP CAP CAP CAP CAP CAP + + + + 转录 DNA P O Z Y A CAP的正调控无葡萄糖，cAMP浓度高时促进转录有葡萄糖，cAMP浓度低时不促进转录

CAP的正调控 葡萄糖乳糖

36 cAMP-CRP与启动子结合的开放结构 cAMP-CRP复合物与启动子的结合是lac mRNA合成起始所必需的复合物结合于启动子上游，使DNA弯曲形成稳定的开放型启动子-聚合酶结构阻遏物阻止形成开放结构，抑制RNA聚合酶的功能

Lac操纵子的调控区域－P、O区 37 P区（启动子区）一般是从I基因结束到 mRNA转录起始位点下游5-10bp O区位于-7～+28bp，对称轴+11bp 转录起点 +1 lac 启动子区(P) 阻遏物结合区(O)

1、A基因及其生理功能 五、Lac操纵子中的其他问题乙酰化抑制了β-半乳糖苷酶产物的有害衍生物在细胞内积累，有利于生物进化 β-半乳糖苷酶分解产物（体内积累，有害）半乳糖苷分子乙酰基 β-半乳糖甘乙酰基转移酶（A基因）半乳糖苷分子（IPTG）不能被分解

2、lac基因产物数量上的比较 β-半乳糖苷酶：透过酶：乙酰基转移酶=1：0.5：0.2 翻译水平上受到调节：（1）lac mRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离，从而终止蛋白质链的翻译；（2）在 lac mRNA分子内部，A基因比Z基因更容易受内切酶作用发生降解。

44 3、操纵子的融合与基因工程操纵子在自然条件下可能发生融合 lac操纵子和pur操纵子（负责嘌呤合成）的偶联 5’ 3’ tsx基因突变 pur操纵子 pur操纵子 Lac:IPOZYA Lac:IPOZ 基因工程：lac启动子是强启动子，融合后增加其它蛋白质的合成量

Hey man, I’m constitutive Repressor Promoter LacZ LacY LacA CAP Binding Repressor Repressor Repressor mRNA Operator CAP The Lac Operon:When Glucose Is Present But Not Lactose Come on, let me through RNA Pol. No way！

Hey man, I’m constitutive RNA Pol. Repressor Promoter LacZ LacY LacA X CAP CAP CAP Binding Repressor Repressor Repressor mRNA cAMP cAMP cAMP Repressor Operator CAP The Lac Operon:When Lactose Is Present But Not Glucose Bind to me Polymerase Yipee…! RNA Pol. Lac This lactose has bent me out of shape

Alright, I’m off to the races . . . Hey man, I’m constitutive Repressor Promoter LacZ LacY LacA CAP CAP CAP Binding Repressor Repressor Repressor mRNA cAMP cAMP cAMP Operator CAP The Lac Operon:When Neither Lactose Nor Glucose Is Present Bind to me Polymerase Come on, let me through! RNA Pol. STOP Right there Polymerase

45 小结乳糖操纵子的结构负控诱导系统的过程操纵子模型的具体内容本底水平的表达代谢物阻遏效应 cAMP-CRP复合物的作用

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